重组人胶原蛋白水凝胶和人工真皮分别作为微粒皮移植覆盖物修复全层皮肤缺损的实验研究

发布时间：2020-06-12 21:15

【摘要】：研究背景烧伤和创伤导致的大面积全层皮肤缺损,会引起一系列危及生命的严重后果,因此,快速修复缺损创面至关重要。目前,自体刃厚皮肤移植仍是修复烧伤导致的大面积皮肤缺损的标准治疗方法。大面积烧伤患者自体皮源缺乏,往往需要通过将刃厚皮处理成微粒皮来扩大植皮的扩展比例,但这是以牺牲创面愈合质量为代价的。胶原蛋白是细胞外基质的重要组成成分,与合成材料相比,在促进创面愈合方面具有更优良的生物特性。目前,胶原蛋白大多是从动物结缔组织提取而来,存在一定的病毒隐患,且成本高产量低。将人类胶原蛋白基因导入基因工程菌,通过基因工程技术获取的重组人胶原蛋白安全性高,成本低,能大规模产业化生产。此外,重组胶原蛋白增加了亲水基团,水溶性提高,可制备出胶原蛋白浓度较高的水凝胶。而水凝胶材料的保水性能又能为创面提供湿润的愈合环境,从而加快创面愈合速度,改善愈合质量。由于具备优良的生物特性,胶原蛋白也是制备人工真皮的主要材料。人工真皮主要用来充当真皮修复过程中引导细胞迁移增殖和胶原排列的支架,帮助完成真皮的重构和血管化,可加快创面愈合速度,改善创面愈合后皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性。但目前人工真皮用于全层创面修复需要经过2次手术,增加了病人的痛苦和负担。本研究首先以重组人胶原蛋白为原料制备水凝胶并进行相关性能检测,并选用以猪肌腱胶原蛋白为原料的皮耐克作为人工真皮的代表,然后将该水凝胶和人工真皮皮耐克两种胶原材料分别作为微粒皮移植覆盖物用于修复大鼠全层皮肤缺损创面,并进行创面愈合速度和愈合质量的疗效评价。目的本研究拟制备以重组人胶原蛋白为原料的水凝胶,选用以猪肌腱胶原蛋白为原料的皮耐克作为人工真皮的代表,探索该水凝胶和人工真皮皮耐克分别作为微粒皮移植覆盖物修复全层皮肤缺损创面的治疗效果,为临床修复全层皮肤缺损创面提供参考。方法1.重组人胶原蛋白水凝胶的制备及表征1.1以DMEM/F12培养基配制浓度为10%的胶原蛋白溶液,通过海藻酸盐与Ca2+反应交联得到胶原蛋白水凝胶;1.2观察胶原蛋白溶液成胶后的状态;扫描电镜观察水凝胶微观结构;1.3对水凝胶体外溶胀和降解性能进行检测;1.4将水凝胶包埋在大鼠皮下,观察体内降解速度。2.重组人胶原蛋白水凝胶对部分创面愈合相关细胞的影响2.1CCK-8法评价水凝胶浸提液对Ha Ca T细胞、人成纤维细胞、HUVEC3种细胞的毒性;2.2细胞划痕实验和Transwell实验评价水凝胶浸提液对3种细胞迁移能力的影响。3.重组人胶原蛋白水凝胶与人工真皮皮耐克作为微粒皮覆盖物修复大鼠全层皮肤缺损创面的疗效评价3.1创面愈合速度制备SD大鼠全层皮肤缺损创面模型,移植微粒皮后分别以胶原蛋白水凝胶、人工真皮皮耐克、凡士林纱布作为覆盖物修复创面,以凡士林纱布组作为对照,比较创面愈合速度。3.2创面愈合质量3.2.1创面真皮层形成术后第7天,14天,21天,35天进行创面取材。HE和Masson染色比较各组创面真皮层形成情况,并与正常皮肤组织比较;3.2.2创面基底膜形成Ⅳ型胶原蛋白免疫组化染色比较各组创面基底膜形成情况,并与正常皮肤组织比较;3.2.3创面胶原蛋白沉积通过苦味酸天狼猩红染色、RT-q PCR、WB检测术后第35天创面上皮化后各组胶原蛋白沉积情况,并与正常皮肤组织比较;3.2.4创面TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表达通过免疫组化染色、RT-q PCR、WB检测术后第35天创面上皮化后各组TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表达情况。3.3促进创面愈合的机制研究3.3.1创面细胞增殖速度Ki67免疫组化染色比较各组创面细胞增殖情况,并与正常皮肤组织比较;3.3.2创面毛细血管新生CD31免疫组化染色比较各组创面毛细血管新生情况;3.3.3创面VEGF的表达通过免疫组化染色、RT-q PCR、WB检测早期各组创面VEGF表达情况。3.4 HE和Masson染色观察胶原蛋白水凝胶和人工真皮皮耐克分别作为微粒皮覆盖物时促进全层创面修复的过程。结果1.重组人胶原蛋白水凝胶的制备及表征成功制备出浓度为10%的胶原蛋白水凝胶;电镜下可观察到多孔海绵状结构;在60min达到溶胀平衡,最大溶胀度为1800%;在体外5-6天时降解速度最快,7天降解完全;在体内5天降解约40%,10天降解约80%,15天降解完全。2.重组人胶原蛋白水凝胶对部分创面愈合相关细胞的影响水凝胶浸提液对3种细胞毒性作用均较小,可促进Ha Ca T细胞增殖,成纤维细胞存活率在90%以上,HUVEC存活率在70%以上;细胞划痕实验和Transwell实验均证实水凝胶浸提液可促进3种细胞的迁移。3.重组人胶原蛋白水凝胶与人工真皮皮耐克作为微粒皮覆盖物修复大鼠全层皮肤缺损创面的疗效评价3.1创面愈合速度术后7天、14天、21天水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组创面愈合率均高于凡士林纱布组,差异有统计学意义,水凝胶组与皮耐克组无差异。3.2创面愈合质量3.2.1创面真皮层形成术后21天,水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组均有真皮组织形成,第35天真皮组织较为成熟,与正常皮肤相近,而凡士林纱布组第35天为致密胶原沉积的瘢痕组织;3.2.2创面基底膜形成术后21天,水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组均有连续的Ⅳ型胶原蛋白阳性基底膜样结构形成,第35天基底膜逐渐连续,而凡士林纱布组第35天仍无基底膜形成;3.2.3创面胶原蛋白沉积苦味酸天狼猩红染色、RT-q PCR、WB证实术后35天,水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组创面胶原沉积均少于凡士林纱布组,差异有统计学意义,水凝胶组与皮耐克组无差异;3.2.4创面TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表达免疫组化染色、RT-q PCR、WB证实术后35天,水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组创面TGFβ1、α-SMA表达水平均低于凡士林纱布组,TGFβ3表达水平均高于凡士林纱布组,差异有统计学意义。3.3促进创面愈合的机制研究3.3.1创面细胞增殖速度术后7天、14天、21天水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组创面Ki67阳性(提示高增殖活性)细胞数量均高于凡士林纱布组,差异有统计学意义,水凝胶组与皮耐克组无差异;3.3.2创面毛细血管新生术后7天,皮耐克覆盖微粒皮组创面CD31阳性新生毛细血管数量高于水凝胶组和凡士林纱布组,差异有统计学意义;3.3.3创面VEGF的表达免疫组化染色、RT-q PCR、WB证实皮耐克覆盖微粒皮组术后7天创面VEGF表达水平高于水凝胶组和凡士林纱布组,差异有统计学意义。3.4通过对术后7天、14天、21天、35天创面HE和Masson染色的动态观察证实,水凝胶和皮耐克覆盖微粒皮组促进创面愈合的速度较凡士林纱布组快。结论综合本课题全部研究,我们得到如下结论:1、成功制备出重组人胶原蛋白水凝胶,具有较好的吸水保水性能和合适的降解速率,且上述性能均可以通过调节原料成分比例和交联程度进行调整,制备过程简单,成本低;2、将水凝胶浸提液作用于Ha Ca T细胞、成纤维细胞、HUVEC,证明其对上述3种细胞的毒性作用均不明显,还可促进Ha Ca T细胞增殖和上述3种细胞迁移;3、将胶原蛋白水凝胶和人工真皮皮耐克分别作为微粒皮移植覆盖物修复大鼠全层皮肤缺损创面,以凡士林纱布作为对照,证明二者均可以加快创面细胞增殖速度、促进早期创面毛细血管新生、促进早期创面VEGF的表达,从而促进创面愈合;促进真皮组织和基底膜形成,从而提高创面愈合质量;降低TGFβ1和α-SMA的表达水平,增高TGFβ3的表达水平,从而预防创面过度收缩和减轻瘢痕增生。并首次证明人工真皮皮耐克作为微粒皮覆盖物一步法修复全层皮肤缺损创面的可行性。综上所述,本研究制备的胶原蛋白水凝胶,以及将人工真皮皮耐克作为微粒皮覆盖物一步法修复全层皮肤缺损创面的治疗方法,都为临床全层皮肤缺损创面的修复提供了新的思路。
【图文】：

形貌,水凝胶,形貌,扫描电镜

图 2-1 水凝胶大体形貌图 2-2 水凝胶扫描电镜下结构由图可见，水凝胶成胶性良好，有一定的物理强度。扫描电镜下可观察到水凝胶冷冻干燥后为多孔海绵状结构，该结构具有渗透吸水作用，又能提高创面局部的透气性[25]。2.水凝胶的溶胀度

曲线,水凝胶,下结构,扫描电镜

- 18 -图 2-2 水凝胶扫描电镜下结构由图可见，水凝胶成胶性良好，有一定的物理强度。扫描电镜下可观察到水凝胶冷冻干燥后为多孔海绵状结构，该结构具有渗透吸水作用，又能提高创面局部的透气性[25]。2.水凝胶的溶胀度溶胀度是反映水凝胶吸水性能的重要指标，是水凝胶作为创面敷料的一项重要性能。图 2-3 是胶原蛋白水凝胶在 37℃浸于 PBS 条件下的溶胀度曲线。水凝胶的溶胀度在前 5min 上升速度最快，迅速达到约 1690%，随后溶胀速度逐渐变缓，并在 60min内趋于平衡，平均最大溶胀度约为 1800%，说明水凝胶具有较好的吸水性能，可在早期迅速吸收创面渗液，后期保水保湿，为创面提供湿润的愈合环境，，加速上皮化过程。图 2-4 是水凝胶达到溶胀平衡时冷冻干燥后在扫描电子显微镜下观察到的结构。从图中可以看出，达到溶胀平衡时水凝胶的基本结构仍相对完整，由于吸收水分使得内部
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R64;R318.08

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