ADM-GeIMA复合水凝胶三维打印皮肤真皮替代物的可行性研究

发布时间：2020-06-18 00:57

【摘要】：一、研究背景和目的背景:组织工程皮肤(tissue engineered skin,TES)移植在创面修复中具有较大的应用前景,当前的TES因涉及保存、运输、长时间的制备过程等多种技术问题,还不能满足临床的各种应用需求。三维生物打印为皮肤组织工程提供更强大的技术支持,它应用生物“墨水”定位负载活细胞、核酸和生长因子等,逐层打印,精确构建所需的组织或器官,并可保持较高的细胞活性。然而寻找适合的生物墨水是三维生物打印面临的主要挑战,胶原及明胶由于其良好的生物相容性,是最常用的天然水凝胶,然而这些水凝胶机械性能不足,降解速度较快,用作皮肤支架存在局限性。脱细胞真皮基质(ADM)通过对皮肤组织脱细胞化处理获得,具有与天然细胞外基质(ECM)相似的组分和微环境,适合细胞的黏附,生长和增殖。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)通过对明胶化学修饰后获得,具有广泛可调的机械性能,经蓝光光照几分钟甚至几秒钟后,能够形成高度交联的聚合物。目的:利用三维生物打印技术构建组织工程皮肤——负载成纤维细胞的ADM-GelMA复合水凝胶。制备脱细胞真皮基质并测定其成分,将ADM-GelMA复合水凝胶和单独的ADM水凝胶以及GelMA水凝胶对比,进行三维成型评估,测定流变学特性、微观结构以及细胞增殖活性。二、方法采用低温冷冻、酶消化和化学试剂相结合的方式(0.25%Trypsin/1%Triton X-100)对猪皮进行脱细胞处理,获得ADM,对其成分进行测定。GelMA由浙江大学高分子系实验室提供,取代度为70%。以单独的ADM水凝胶和GelMA水凝胶作为对照组,以ADM-GelMA复合水凝胶作为实验组,将成纤维细胞悬液与水凝胶均匀混合,应用挤出型三维打印机进行三维成型评估。利用CCK-8测定各组水凝胶中细胞的增殖活性,使用活细胞死细胞试验评价打印后的组织构建体中成纤维细胞(Fbs)的活性,用扫描电子显微镜观察支架的微观结构。采用Student-t检验对数据进行统计分析。三、结果(1)苏木素/伊红(HE)染色结果显示,ADM中几乎没有镜下可见的细胞残留,经过脱细胞步骤后,由于去除一定量的细胞成分,胶原的含量有所提高,糖胺聚糖(GAG)的含量是脱细胞前GAG含量的54.5%。(2)三维打印结果显示:GelMA水凝胶和ADM-GelMA复合水凝胶在打印过程成均能实现快速交联,具有良好的结构保真度,ADM水凝胶由于交联时间较长(半小时),打印过程中逐渐出现结构塌陷。(3)扫描电镜观察结果显示,三种水凝胶均具有相互交通的孔隙结构。(4)CCK-8测定结果显示,ADM水凝胶和GelMA水凝胶中成纤维细胞(FBs)的增殖活性均随着水凝胶浓度的增加而降低,ADM水凝胶和ADM-GelMA复合水凝胶中FBs的细胞增殖活性大于5%GelMA。(5)活细胞死细胞染色以及鬼笔环肽/Hoechst33258染色结果显示,第7天时FBs在水凝胶中均生长良好,说明打印过程对细胞的损害几乎可以忽略。四、结论本实验设计了负载成纤维细胞的ADM-GelMA复合水凝胶,用于三维打印构建皮肤真皮替代物。研究结果表明,负载成纤维细胞的ADM-GelMA复合水凝胶同时具备良好的生物相容性以及较强的机械性能,并且凝胶化时间短,打印构建体保真度高,是用于三维生物打印较具前景的生物墨水,将来有望作为皮肤真皮替代物应用到皮肤创面修复中。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08
【图文】：

水凝胶,溶胀比,动态频率,三维打印

３三维打印ＡＤＭ水凝胶逡逑应用挤出型三维生物打印机，我们成功打印了直径３０ｍｍ，高ｌｍｍ的生物构逡逑建体（图１．３Ａ）。１．５％ＡＤＭ水凝胶由于交联时间长，粘滞度不足，在打印过程中逡逑逐渐出现塌陷塌陷，细丝直径在１ｍｍ。逡逑１１逡逑

水凝胶

４体外测定细胞活性逡逑为评价不同浓度的ＡＤＭ水凝胶中ＦＢｓ的增殖活性，我们对其进行ＣＣＫ－８测定。逡逑结果显示，随着ＡＤＭ水凝胶浓度的增加，ＦＢｓ的增殖活性逐渐降低（图１．４），１％ＡＤＭ逡逑和１．５％ＡＤＭ水凝胶中ＦＢｓ的细胞增殖活性明显高于２％ＡＤＭ水凝胶，考虑到逡逑１．５％ＡＤＭ具有较好的生物相容性；且与１％ＡＤＭ水凝胶相比更适合应用到挤出型逡逑三维打印机，因此我们选定１．５％ＡＤＭ作为对照组。逡逑１．２０逡逑，００邋１邋—逡逑０．８０逡逑Ｈ邋０．６０逡逑：ｉ．．邋ｉｌｌ逦ＩＩＩ逡逑Ｄ１逦Ｄ３逦Ｄ７逡逑■邋１．０％ＡＤＭ邋■邋１．５％ＡＤＭ邋■邋２％ＡＤＭ逡逑图１．４邋１％ＡＤＭ水凝胶、１．５％ＡＤＭ水凝胶以及２％ＡＤＭ水凝胶的ＣＣＫ－８测定值（＊／７＜０．０５）逡逑１２逡逑

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