预血管化细胞膜片复合GelMA水凝胶伤口敷料的构建及其基础应用的研究

发布时间：2020-06-18 20:06

【摘要】：目的:本实验采用细胞膜片技术以及甲基丙烯酸明胶(GelMA)构建预血管化伤口敷料,将其作用于裸鼠的皮肤缺损处,观察该敷料对伤口愈合的影响,为临床中皮肤损伤的修复提供一种新的治疗思路。方法:1)预血管化细胞膜片的构建及表征:提取兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代培养至P2代备用;运用MTT法测定兔BMSCs的生长曲线;检测兔BMSCs的多向分化能力;培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs);高密度接种兔BMSCs到培养皿培养10天后,接种HUVECs共培养5天,免疫荧光染色观察预血管化的细胞膜片内I型胶原的形成情况。2)预血管化细胞膜片复合GelMA水凝胶敷料的构建:光交联制备甲基丙烯酸明胶并利用FTIR、XRD等对其理化性质进行表征,将预血管化细胞膜片进行折叠至三层并与GelMA水凝胶共培养构建预血管化伤口敷料。3)预血管化敷料运用于裸鼠伤口愈合的实验:构建裸鼠全层皮肤缺损模型,将构建的预血管化敷料作用于裸鼠伤口,分别在第1天、第7天、第14天观察伤口愈合情况,并提取伤口处组织样品进行组织学染色,研究此敷料对宿主伤口愈合的影响。结果:1)倒置光学显微镜下可观察到兔BMSCs呈长梭形,MTT实验结果示兔BMSCs的生长曲线成“S”形;多向分化实验结果示兔BMSCs具有向成脂、成骨、成软骨细胞分化的能力;免疫荧光染色发现BMSCs膜片中细胞含量较高,细胞外基质丰富,细胞与细胞之间连接存在,含有大量的I型胶原纤维;在预血管化细胞膜片上,HUVECs在水平、垂直方向上均发生迁移并在BMSCs上形成网络结构。结果表明,BMSCs膜片为HUVECs的生长和迁移提供了3D环境。2)FTIR结果表明甲基丙烯酸对明胶蛋白骨架结构没有显着影响,BMSCs在GelMA水凝胶的细胞相容性实验中表现出较高的成活率。3)裸鼠背部预血管化构建体移植成功,实验组愈合速度快于对照组;免疫组织化学染色进一步显示,在预血管化构建体中体外预先形成的微血管结构与宿主脉管系统发生吻合。结论:实验结果表明由预血管化干细胞膜片与GelMA水凝胶构建的新型皮肤敷料在免疫缺陷鼠的皮肤缺损修复再生实验中显示出具有促进伤口愈合的功能,但仍需大量的基础实验及临床研究进一步探究其促进伤口愈合的机制。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08
【图文】：

兰州大学硕士学位论文 预血管化细胞膜片复合 GelMA 水凝胶伤口敷料的构建及其基础应用的研究时可以促进管腔的形成并能够保持其长期稳定性[42]。在研究当归（AS）提取物对体外人内皮细胞（HUVECs）和体内斑马鱼的血管生成作用时发现 AS 提取物可以促进 HUVECs 的数量、迁移量和血管平均长度的显着增加[43]。共培养HUVECs 和多形性胶质母细胞瘤（GBM）来构建体外 3D 血管模型，并探究 VEGF在该模型中介导毛细血管等小血管形成中的作用，发现 GBM 分泌的 VEGF 能够诱导 HUVECs 形成微血管腔[44]。综上，研究发现，虽然 HUVECs 是生物组织工程中重要的血管形成细胞，但是单独的 HUVCEs 无法独立完成血管网络的构建，因此需要特定的细胞外基质，其中含有各种促进血管生成的生长因子，最好是该细胞外基质自身能够持续不断地自发的去生成血管生成所需要的生长因子以及其他介质，在目前的研究中发现 MSCs 作为外周细胞可以通过自生的分泌为内皮细胞的血管化提供所需的各种介质，已经成为组织再生血管构建中十分重要的血管周围细胞。

而 VEGF 分泌几乎保持恒定[73]。VEGF 和 HGF 分泌物之间的对比结果也可能与多层 HSMM 片中的缺血情况有关。众所周知，低氧诱导 VEGF 分泌[74]，并且在常氧条件下促进 HGF 分泌[75]。有研究发现将细胞膜片技术和静电纺丝支架结合起来，快速构建出能够立即表达收缩基因的周向排列的人体主动脉平滑肌细胞的管状构建体，用于培养工程化血管组织结构[76]。也有研究发现在预血管3D 组织结构中，用内皮细胞集落形成细胞（Endothelial cell colony forming cells,ECFCs）代替人脐带血管内皮细胞（HUVECs）与成纤维细胞膜片共培养后 3 天在成纤维细胞片构建体中发现了管腔结构[47]。Kang 等将细胞膜片技术与组织工程支架技术进行了结合来构建高水平的血管组织，基于细胞膜片工程技术整合血管化的仿生细胞膜片工程骨膜（CSEP）和可生物降解的大孔 β-磷酸三钙（β-TCP）支架来设计血管化骨移植物骨膜（如图 1.2），该构建体不仅能够模仿天然骨膜的空间构型，而且还能促进骨移植物的血管化和成骨潜能[38]。因此，细胞膜片技术在目前生物组织工程的构建中十分重要的，特别是预血管化细胞膜片的构建。

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本文编号：2719765