通过氢键相互作用调控树形高分子的基因转染效率及其生物医学应用

发布时间：2020-06-28 18:19

【摘要】：树形高分子是一种高分子聚合物基因载体,分子表面的伯胺基团可以高效地浓缩核酸分子,形成转染复合物；分子内部的三级胺具有pH缓冲能力,可以吸收大量的氢质子,帮助转染复合物从内涵体中逃逸。但是,树形高分子的基因转染效率有限,并且分子表面大量的伯胺基团会导致严重的细胞毒性。因此,有必要对树形高分子进行表面功能化修饰,改善树形高分子的转染效率和细胞毒性。研究表明,在树形高分子进行多种功能化修饰,可以有效提高树形高分子基因转染效率、降低自身的细胞毒性。这些修饰的作用主要是调控树形高分子的理化性质,如氨基酸修饰可以调控表面电荷密度和内涵体逃逸能力；脂质分子可以调控亲疏水平衡；氟化修饰可以调控自组装性能,糖基化和蛋白修饰可以提供靶向能力。然而,大多数表面功能化修饰对于树形高分子转染效果的提高有限,细胞毒性问题也没有很好地解决,远不能胜任基因治疗的任务。所以如何通过新的机制以树形高分子为平台设计出高效、低毒、具有基因治疗价值的基因运输载体成为研究的难点。本文提出了一种新的表面功能化修饰策略,即在树形高分子表面共价修饰含有氢键供、受体的二氨基三嗪(DAT)基团,通过氢键相互作用调控树形高分子的基因转染效率。DAT基团能够(1)与核酸分子中的碱基发生氢键相互作用,辅以树形高分子表面伯胺基团的静电相互作用协同结合核酸分子,形成良好的转染复合物；(2)与三聚氰酸(CyA)分子通过多重氢键识别将低代数(G3)树形高分子自组装成大分子量基因载体,从而设计出高效、低毒、可用于基因治疗的基因运输载体。本文的主要研究方法及结论如下：(1)在高代数树形高分子表面共价修饰DAT基团,制备了具有氢键供、受体的基因载体。DAT可以与碱基形成多重互补氢键,在与静电结合的协同作用下,能够在水中将DNA浓缩形成稳定的转染复合物,可以有效地保护DNA免受DNA酶的降解。DAT修饰可以提高转染复合物的细胞摄入,使其在多种细胞系,如HEK293、COS-7、HO和HeLa细胞中展现出非常高的基因转染效率,甚至好于商业化转染试剂bPEI 25KD和Lipofectamine 2000。并且,DAT修饰也赋予了树形高分子非常好的抗血清能力、细胞穿透能力、改善的细胞毒性和极低的溶血能力,使其有望应用于基因治疗领域。此外,在树形高分子表面修饰其他氢键配体,如碱基衍生物,或将DAT基团修饰在其他阳离子聚合物上,同样能够大幅提高基因载体的基因转染效率,说明这种氢键修饰是一种广泛适用的修饰策略,对于构建新型的基因载体具有参考价值。(2)上一部分研究已经表明DAT修饰的树形高分子可以作为高效的基因载体,因此在这一部分中将所制得的基因载体用于基因治疗。非小细胞肺癌细胞系PC-9中高表达MDM2蛋白,以MDM2基因为靶点,向PC-9细胞中运输MDM2siRNA,干扰MDM2蛋白表达,可以激活p53信号通路,诱导癌症细胞PC-9凋亡。DAT修饰的树形高分子基因载体,能够高效运输MDM2 siRNA,沉默MDM2蛋白的表达,在细胞水平上能够高效诱导非小细胞肺癌细胞系PC-9的凋亡,其效果好于商业化转染试剂Lipofectamine 2000;在动物水平上,可有效抑制裸鼠模型中PC-9皮下肿瘤的生长。这些结果证明DAT修饰的树形高分子不仅可以作为高效的DNA载体,也可以作为高效的siRNA载体。(3)传统的阳离子聚合物基因载体在转染效率和细胞毒性之间存在一个恶性关联,即分子量越大,转染效率越高,随之细胞毒性也越高。而通过可降解的交联剂(如含有二硫键)构建具有生物降解性能的阳离子聚合物可以在提高基因转染效率的同时保持极低的细胞毒性。然而,这种交联方式具有不稳定和可控性差等问题,对于基因载体的合成、保存、以及批次与批次之间的一致性都要求非常高。为了解决这个棘手的问题,本章节通过氢键自组装的方式,以非共价方式构筑新型基因载体,即利用CyA分子与DAT基团之间多重氢键识别进行自组装。在低代数(G3)树形高分子表面共价修饰DAT基团,通过其与CyA之间的多重氢键识别自组装形成具有超分子结构的基因载体。其中,CyA可以辅助浓缩核酸分子,形成更加紧凑的转染复合物,提高转染复合物的稳定性,保护DNA免受核酸酶降解；还可以有效提高转染复合物的细胞摄入。在HEK293和COS-7细胞中,这种超分子基因载体具有高效的基因转染效率,与商业化转染试剂bPEI25KD相当。而且,加入的CyA分子不会增加额外的细胞毒性。将多重氢键识别改为单氢键识别(CyA和4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪,DMT)时,不能增加转染复合物的细胞摄入,且基因载体丧失转染效率,说明多重互补氢键识别对于超分子基因载体的稳定性和转染高效性至关重要。这种氢键自组装策略简单易行,而且打破了载体分子量—转染效率—细胞毒性之间的恶性关联,实现了低代数树形高分子高效、低毒的基因转染,对于研发新型基因转染材料意义非凡。简而言之,本论文利用氢键配体分子之间氢键识别,或是调控基因载体与核酸分子之间转染复合物的形成,或是调控基因载体的形成,能实现高效的基因转染与基因治疗,并维持较低的细胞毒性。氢键调控有望发展成为一种提高树形高分子基因转染效率的新策略。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R318
【图文】：

核酸,化学结构,非病毒载体,病毒载体

理想的基因载体，应该能够有效地结合、包裹核酸物质，在体内循环的过程逡逑中保护核酸免受核酸酶的降解，并且能够穿越包括细胞膜在内各种生物屏障，将逡逑核酸物质输送到所要发挥作用的位置（图１．１）。在近２０年的基因治疗临床试验逡逑中，最主要、最成功的基因载体是病毒载体，主要包括腺病毒、逆转录病毒和慢逡逑病毒，治疗范围涵盖从神经性疾病到癌症等广泛领域［４］。病毒载体在基因运输中逡逑具有多种优势：能够在宿主体内保持稳定，识别潜在的宿主细胞，体内运输效率逡逑高［５］。但是，病毒载体的缺陷也极为明显，比如目的基因容量比较小，无法大规逡逑模制备且比较昂贵，更为人诉病的是与身俱来的感染性和寄生性，使其在基因治逡逑１逡逑

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现今主流的非病毒基因载体可分为两种，一种是脂质体载体，另一种是高分逡逑子聚合物载体。树形高分子（Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）是一种人工合成的高分子聚合物，具逡逑有精确层状结构和尺寸，在溶液中呈球状或椭球状（图１．２）。其名称来源于希腊逡逑词汇（Ｄｅｎｄｒｏｎ），即“树”的意思。通常，树形高分子由三部分组成，第一个是逡逑处于中央的内核部分，作为树杈结构延生的核心（Ｃｏｒｅ）；第二个是由逐步合成逡逑方法从每一个树杈节点延生出来的重复单元部分，每合成一层，即为一代逡逑（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．邋Ｇ），重复单元的长短、结构和代数的多少决定树形高分子的尺寸、逡逑结构和内部空腔；第三个是处于树形高分子表面的官能基团（Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ），逡逑它赋予了树形高分子的表面性质，是树形高分子多共价效应的基础［９］。由于树形逡逑高分子独特的合成方法学，使得树形高分子拥有精确的分子量、分子结构和纳米逡逑尺寸

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