脱细胞猪角膜基质载体支架的制备及其与人角膜基质细胞的生物相容性研究

发布时间：2020-07-07 03:27

【摘要】：角膜是位于眼球最前端的一层透明薄膜，呈横椭圆形，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。角膜从解剖结构上可分为5层：上皮层、前弹力层（Bowman层）、基质层、后弹力层（Descemet膜）、内皮层。其中基质层约占角膜总厚度的90%，含有大量规则排列的胶原纤维板，分枝状的角膜基质细胞则铺展于胶原纤维之间，对维持角膜的透明性发挥着重要作用。角膜疾病是仅次于白内障的第二大致盲主因，其中，由角膜基质缺损所导致的角膜盲占多数。目前，角膜移植是治疗角膜盲的唯一有效手段，但由于供体角膜严重不足，我国眼库每年仅能提供约一千余人手术所用眼角膜。因此，寻求良好的角膜等效替代品是解决供体角膜数量不足的重要途径。随着组织工程研究的不断推进，通过体外重建获得具有生物活性的组织工程角膜成为可能。组织工程人角膜基质有望成为供体角膜基质的等效替代物，从根本上解决捐献角膜高度匮乏的问题。支架材料在组织工程角膜研究中起关键作用，它不仅为细胞提供结构支撑，而且还起到模板的作用，引导组织再生和控制组织结构。因此，选择一种具有良好生物相容性和特定形状结构的支架材料是组织工程角膜成败的关键因素。本文以猪角膜为研究材料，选择合适的脱细胞方法，制备出理想的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stroma，aPCS）载体支架，并利用本实验室自行建立的非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系对制备的aPCS支架进行了鉴定和生物相容性研究，为组织工程人角膜基质及组织工程全角膜的体外重建奠定了基础。本文利用0.5%脱氧胆酸钠联合DNase/RNase对猪角膜进行脱细胞处理，彻底去除支架内残留的核物质，经风干处理后制备出脱细胞猪角膜基质支架。利用石蜡切片HE染色和冰冻切片DAPI荧光染色等方法鉴定脱细胞效果，利用阿利新兰染色法鉴定细胞外基质成分的保存情况，利用石蜡切片HE染色和透射电镜观察等方法鉴定胶原板层结构的维持。结果显示，制备出的aPCS支架无角膜基质细胞膜碎片和核酸碎片残留，糖胺聚糖分布与对照相似，胶原纤维排列整齐规则，表明aPCS支架保持了完整的细胞外基质结构和糖蛋白成分。此外，脱细胞猪角膜基质光学透明度良好。为了检测支架与细胞的生物相容性，利用注射法将非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系接种在制备好的脱细胞猪角膜基质支架，通过冰冻切片HE染色及免疫化学染色方法对其进行了鉴定。结果显示，细胞接种1天、3天、5天及7天，脱细胞猪角膜基质支架内部的胶原纤维板层间均有人角膜基质细胞的定位，且随着时间的延长，细胞呈现向外扩散的趋势。人角膜基质细胞在支架内能够阳性表达基质细胞的标志蛋白-波形蛋白，细胞连接蛋白-整联蛋白β1、间隙连接蛋白-43，基质细胞功能蛋白-乙醛脱氢酶3A1、钠钾泵、钙泵，细胞生长增殖相关蛋白-K-Ras、STAT3、CDK2，分化相关蛋白-CD34，这与体外培养的人角膜基质细胞表达情况相同。以上结果表明细胞在支架内生长状态良好，能够发挥正常功能，证实支架的生物相容性良好，能够为细胞的生长、分化及正常功能的发挥提供适宜的环境。综上所述，本文利用新鲜猪角膜成功制备了脱细胞猪角膜基质支架，该支架无角膜基质细胞残留，糖胺聚糖分布正常，胶原纤维排列整齐规则，透明度高。将人角膜基质细胞系细胞接种到aPCS支架后，细胞生长状态良好、增殖分裂旺盛，基质细胞标志性蛋白、连接蛋白、功能蛋白、生长增殖相关蛋白及分化相关蛋白均表达为阳性，表明制备的脱细胞猪角膜基质支架具有良好的生物相容性，为组织工程角膜基质及组织工程全层角膜的体外重建奠定了基础。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【图文】：

照片,中角,膜片,处理过程

图 2-1 脱细胞处理过程中角膜片跟踪观察照片Fig. 2-1 Transparency of porcine cornea during acellular processA: 正常猪角膜; B: 溶胀 12h 并去除上皮; C: 脱细胞缓冲液处理 8h; D: 反复冻融;E：DNA- RNA 酶处理 4h; F: 风干后; G: 复水 12hA: Normal porcine cornea; B: Hydrating for 12h and removing epithelium; C: Treatment withdecellularization buffer for 24 h; D: Repetitive freeze-thawing; E: Treatment with DNase/RNasefor 4 h; F: Air-dried; G: Rehydrating for 12h.3.1.2 透光率如图 2-2 所示，风干 12h 的 aPCS 支架透光率达到了 96.43%±1.6%，复水后aPCS 支架透光性有所下降，为 78.50%±5.4%。

照片,复水,透光率

图 2-1 脱细胞处理过程中角膜片跟踪观察照片Fig. 2-1 Transparency of porcine cornea during acellular proces膜; B: 溶胀 12h 并去除上皮; C: 脱细胞缓冲液处理 8h; D:E：DNA- RNA 酶处理 4h; F: 风干后; G: 复水 12hporcine cornea; B: Hydrating for 12h and removing epithelium; C: Ttion buffer for 24 h; D: Repetitive freeze-thawing; E: Treatment withfor 4 h; F: Air-dried; G: Rehydrating for 12h.-2 所示，风干 12h 的 aPCS 支架透光率达到了 96.43%±1光性有所下降，为 78.50%±5.4%。

组织结构变化,处理过程,板层,角膜

3.2.1 脱细胞猪角膜基质HE染色结果如图 2-3A 所示，新鲜猪角膜与人类角膜较相似。溶胀、撕除上皮后，上皮细胞基本被去除，角膜基质层中有较多细胞残留（图 2-3B）。脱细胞缓冲液处理8h 后，上皮细胞被彻底去除，基质中仍残留少量细胞，角膜胶原板层结构变得较为松散（图 2-3C）。经过反复冻融后，基质层中残留的细胞基本被去除，胶原板层结构较之前无明显变化（图 2-3D）。之后经 DNA-RNA 酶处理后，残留的微量核物质被彻底去除（图 2-3E）。风干处理后，胶原纤维结构恢复整齐排列，无局部结构破坏（图 2-3F）。3.2 脱细胞猪角膜基质的组织结构

【相似文献】