微脉冲阈值下激光光凝对小鼠视网膜色素上皮细胞的生物调制效应

发布时间：2020-07-22 15:16

【摘要】：背景：黄斑是人类视觉最敏锐,最关键的部位,视网膜静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、视网膜血管炎等继发的黄斑水肿,中心性渗出性脉络膜视网膜病变、湿性老年性黄斑病变、病理性近视等发生黄斑脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization, CNV)等,是许多严重致盲性眼底疾病的基本病理改变,可造成严重的视力丧失,且与之相关的眼底病变众多,发病呈上升趋势,但目前尚缺乏有效防治设施和手段,给社会和家庭带来沉重的负担。1961年,视网膜激光光凝器在激光发明仅一年时间之后问世,为眼底疾病的治疗带来革命性的改变,许多眼底病最终只能通过激光治疗来控制或延缓病情的发展,目前激光已成为眼科临床强有力的治疗手段,为此挽救了无数眼底病患者的视力。随着激光技术应用的不断深入,临床医生在应用激光治疗眼底病的同时也逐渐认识到其对眼底组织的破坏作用。一直以来,我们普遍接受一种观点：当激光辐射至眼底时,眼内色素组织如(黑色素、血红蛋白、叶黄素等)将大部分激光能量吸收并将其转变为热量。大约经过lms后,热量开始向附近组织扩散,引起邻近组织温度上升。当组织局部温度超过基础体温的20-30℃时,将引起周围组织蛋白质的变性,细胞部分或者完全失去活性,光凝靶组织颜色变白或者发灰,即形成所谓的光斑。光凝斑对组织造成的损伤可以是暂时的或永久的,而且进展缓慢。传统激光治疗眼底病时光凝可破坏掉高耗氧的光感受器细胞及RPE细胞,减少代谢需求,改变视网膜缺氧状态,增加眼球内的氧张力和改善包括血管内皮生长因子在内的血管因子的产量。然而,这种阈值上视网膜光凝带来视网膜的损伤及引发的炎症反应增加了治疗的风险及副作用,虽然与不进行治疗相比,阈值上光凝有确切的好处,但是激光治疗获益的同时也伴随着严重的光感受器和脉络膜毛细血管的破坏,以及治疗时产生炎症,导致视网膜前和视网膜下纤维化,激光瘢痕可在光凝后扩大,中心视力可能退化,并有可能发生脉络膜新血管形成,出血,视网膜外层纤维化以及周边视网膜脉络膜脱离,并可导致视觉敏锐度的下降,视野的缩小,色觉、夜间视力以及对比敏感度的下降。由于不小心造成的黄斑中心凹光凝可造成视力的早期或者晚期丧失。由此可见,激光导致的视网膜损伤,限制了它的治疗密度及可重复性,同时限制了治疗黄斑中心凹及中心凹附近病变的安全性,而黄斑水肿导致黄斑病变是众多眼底病最常引起视力下降的原因。最近部分学者提出新的假设：视网膜光凝可能通过有功能视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌细胞因子水平的上调或者下调来发挥治疗效应。这也提示了治疗的效应可能是通过非损伤的RPE细胞来发挥效应,治疗视网膜血管病时带来的视网膜损伤也许没有必要。实际上,不管运用何种激光类型或者激光在哪层眼底组织吸收,在修复血-视网膜屏障过程中发挥关键作用的是RPE细胞。本实验以C57BL/6小鼠视RPE细胞为实验模型,将810nm半导体激光作为光源对C57BL/6小鼠RPE细胞进行干预,观察不同负载系数、不同功率的半导体激光作用小鼠RPE细胞后,RPE细胞活性及促血管生长因子：血管内皮生长因子A(VEGF-A)、转化生长因子beta(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及抑血管生长因子：色素上皮源性因子(PEDF)分泌水平的变化,研究810nm半导体激光阈值下不同负载系数、不同功率半导体激光对RPE细胞凋亡的影响,从而为黄斑区病变的激光治疗增添新的思路。方法：1、细胞培养：采用一步酶消化法分离获取小鼠RPE细胞。RPE细胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养基中于37℃、5%CO2培养箱中培养,以生长曲线、细胞分裂时间等指标观察细胞生存活力及增殖状态;以光镜、免疫组织荧光法鉴定RPE细胞,取第三代对数生长期细胞进行实验。2、选择合适的激光负载系数,使得激光在此种负载系数下对RPE细胞的损伤最小：首先,RPE先随机分成两组(L组及H组),L组激光负载系数为5%,H组为10%。两组共同的激光参数如下：激光直径：75μm,功率：100 mW、200 mW、300 mW及400mW,包络时间l00ms。激光干预前后24小时,RPE细胞培养液不加胎牛血清。激光干预RPE细胞24小时后,行MTT比色法测定测定每孔吸光度值(OD值),并计算细胞生长抑制率%=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。3、Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测RPE细胞凋亡率：根据MTT结果选择对细胞损伤作用较小的负载系数为5%的激光作为光源,取对数生长期的RPE细胞,按分组予以不同处理因素：O组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=0mW),P组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=100mW),Q组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=200mW),R组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=300mW)and S组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=l00ms,功率=400mW),作用24h,进行流式细胞检测,用Cell Quest软件进行数据分析。认为Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI为凋亡细胞,每次计数10000个细胞,计算凋亡率。4、Western blot法测定RPE细胞VEGF-A, TGF-p,bFGF,PEDF蛋白表达：取对数生长期细胞,以0组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=0mW),P组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=100mW),Q组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=l00ms,功率=200mW),R组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=300mW)and S组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=400mW),以等量DMEM/F12培养基为空白对照,作用24小时后,行western blot法测定各组细胞VEGF-A, TGF-β, bFGF, PEDF表达,以β-Actin作为内参照,用AlphaEase FC软件分析,测定各组靶蛋白及内参照蛋白的灰度值,以同一样品中目的蛋白与内参灰度值的比值作为蛋白的相对含量。5、RT-PCR法测定RPE细胞VEGF-A, TGF-p, bFGF, PEDF的nRNA表达：取对数生长期细胞,以0组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=0mW),P组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=100mW),Q组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=200mW),R组(负载系数=5%,激光光斑=75μm,包络时间=100ms,功率=300mW)and S组(负载系数=5%,激光光斑=751μm,包络时间=100ms,功率=400mW),以等量DMEM/F12培养基为空白对照,运用激光干预RPE细胞24小时后,我们通过RT-PCR及2-△△CT法检测分析VEGF-A, TGF-p, b FGF和PEDF的基因相对表达量,P-actin设为内参。6、统计分析：实验数据用SPSS 19.0软件分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用q检验,以P0.05表示差异具有统计学意义。结果：1、倒置相差显微镜下RPE细胞形态变化：初分离的的黑色、圆形RPE细胞在1d后开始贴壁,3d后可见淡黑色、短梭形的RPE细胞且细胞数量较前成倍增多,5d后细胞约80%单层融合长满瓶底,7d后细胞基本单层融合长满瓶底,呈典型的鹅卵石铺地样。1：2传代的细胞生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色颗粒,2-3d后达融合状态,细胞呈梭形及不规则形。Keratin免疫荧光鉴定显示所获细胞是色素上皮源性细胞,且细胞纯度接近99%。2、激光在5%负载系数模式下对RPE细胞活性抑制作用更小：MTT法分别检测不同功率下5%负载系数及10%负载系数激光对RPE细胞的生长抑制作用,结果显示激光(负载系数5%及10%)照射24小时后,细胞活性以负载系数依赖及能量依赖模式受到抑制,然而,激光在5%负载系数模式下对RPE细胞活性抑制作用更小(P0.05),且在5%负载系数,能量为100mW及200mW时,细胞活性不受抑制(P0.05)。3、激光在5%负载系数模式下诱导更少的RPE细胞凋亡率：行Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测5%负载系数激光在不同功率下RPE细胞的凋亡率,结果显示：O组(功率=0mW)细胞凋亡率为(3.68±0.27)%,P组(功率=100mW)细胞凋亡率为(3.52±0.36)%,Q组(功率=200mW)细胞凋亡率为(3.58±0.29)%,R组(功率=300mW)细胞凋亡率为(9.31±0.59)%、S组(功率=400mW)细胞凋亡率为(14.24±0.45)%,R组(功率=300mW)、S组(功率=400mW)凋亡率显著提高,存在显著性差异(P0.05),激光设置在5%负载系数,功率为100mW及200mW时,细胞凋亡率最低且与对照组O组(功率=0mW)一致(P0.05)。4、激光在5%负载系数模式下诱导RPE细胞VEGF-A, TGF-β, b FGF和PEDF蛋白的表达：Western blot结果显示：与对照组相比,激光干预24小时后,各个功率组促血管生长因子(VEGF-A, TGF-β and b FGF)表达下调(*P0.05),抑血管生长因子(PEDF)表达上调(*P0.05),实验组之间因子水平的改变没有统计学差异(P0.05)。5、激光在5%负载系数模式下诱导RPE细胞VEGF-A, TGF-β, b FGF和PEDF基因的表达：RT-PCR结果显示：与Western blot法检测结果相一致,与对照组相比,激光干预24小时后,各个功率组抑血管生长因子(VEGF-A, TGF-β and b FGF)基因相对表达下调(*P0.05),促血管生长因子(PEDF)基因相对表达上调(*P0.05)。实验组之间因子水平的改变没有统计学差异(P0.05)。结论：我们的结果显示：与10%负载系数的工作模式相比,810nm半导体激光在5%负载系数的工作模式下对RPE细胞活性抑制作用更小,甚至在5%负载系数,功率=100mW与200mW工作模式时,810nm半导体激光诱导的RPE细胞凋亡率与空白对照组没有统计学差异,同时可引起血管抑制生长因子(PEDF)的高表达,而抑制促血管生长因子(VEGF-A, TGF-β及bFGF)水平的表达。这提示了通过控制负载系数及功率,微脉冲阂值下激光有望实现视网膜血管疾病的阈值下光疗。当然体内细胞因子相互作用网络很复杂,CNV形成机制仍在研究,微脉冲阈值下半导体激光是否能通过对RPE阈值下照射来治疗CNV,以及作用机制仍需要更多的体内及体外实验来验证和研究探讨。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R779.63
【图文】：

细胞,初分离

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细胞,初分离

【共引文献】