基于难愈创面修复的生物活性支架制备及机理研究

发布时间：2020-07-31 18:11

【摘要】：难愈创面愈合过程中多因素受损导致的,它被定义为不能持续的进行创面愈合过程或不愈合的创面。常见的难愈创面包括糖尿病溃疡、烧烫伤、褥疮等等。由于近年来难愈创面的发病率显著增高,与之相关的长期高成本的医疗护理,患者的生活质量下降和社会资源的浪费,使难愈创面已成为严重的全球公共卫生挑战。糖尿病创面的难以愈合主要是由于缺氧,成纤维细胞和表皮细胞功能障碍,血管生成和新血管形成受损,细胞损伤以及神经病变等因素导致的。传统的创面敷料存在价格昂贵,新生血管率低、创面修复速率缓慢、容易产生瘢痕组织和新生组织缺乏皮肤附属器官等问题。因此,制备出可以克服这些问题的具有高生物活性的用于糖尿病创面快速愈合的新型修复材料仍然是一个重大挑战。生物活性玻璃由于其高生物相容性和离子产物的积极生物效应,已经在硬组织和软组织修复中显示出成功的应用。近期研究表明,生物活性玻璃在创面修复中具有促进血管再生和创面愈合等效果,但是生物活性玻璃促进创面修复的机理尚未明确,并且纯生物活性玻璃由于其脆性特征而难以用作皮肤组织工程的皮肤替代物和支架。静电纺丝纳米纤维由于其仿生天然细胞外基质纳米纤维结构,高比表面积和高孔隙率,在创面修复领域显示出巨大前景。然而,由于糖尿病创面复杂的生理微环境,传统的静电纺丝纳米纤维在作为创面敷料时,并没有达到很好的愈合效果。通过对静电纺丝纳米纤维进行功能化构建,与生物活性玻璃复合或制备出具有药物缓释效果的创面敷料,有望研发出新型的针对难于创面修复的创面敷料。本文首先系统的研究了具有微纳米结构的58s生物活性玻璃促进肌成纤维细胞向脂肪细胞分化的作用及机理。通过与传统静电纺丝技术相结合,制备出了Ⅰ型胶原/聚己内酯/生物活性玻璃复合纳米纤维支架。系统的评估了这种复合支架对糖尿病创面修复的效果,并深入的研究了其修复机理。此外,针对研究中发现的糖尿病创面细胞对缺氧环境的异常响应,制备出内层负载DMOG的同轴静电纺丝纳米纤维支架,解决了糖尿病创面修复过程中修复因子不能正常表达的问题。主要研究工作和研究结果如下:(1)以十二胺为模板剂,制备出具有良好分散性的58s生物活性玻璃。研究了不同浓度的58s生物活性玻璃对巨噬细胞分泌BMP-2的调控作用,和促肌成纤维细胞向脂肪细胞分化的作用及机理,并且通过体内实验进行验证。结果表明:生物活性玻璃能促进巨噬细胞分泌BMP-2,从而促进肌成纤维细胞向脂肪细胞的分化。进一步对BMP-2促进肌成纤维细胞向脂肪细胞分化的分子机制研究显示:BMP-2能通过SMAD1及P38信号通路促进肌成纤维细胞分化,抑制这两条信号通路会抑制脂肪细胞的形成。同时体内实验进一步证明,生物活性玻璃的加入可以促进创面修复过程中肌成纤维细胞向脂肪细胞分化,从而有效的减少创面修复过程中瘢痕组织的形成。(2)使用静电纺丝技术制备复合了生物活性玻璃的Ⅰ型胶原/聚己内酯纳米纤维支架。考察了该复合支架对内皮细胞的影响,并且研究了该支架对糖尿病大鼠创面修复的影响。对于创面修复过程中发现复合材料促进血管再生的情况,研究了HIF-1α/VEGF信号通路,证明生物活性玻璃复合纳米纤维材料可以通过HIF-1α/VEGF信号通路促进难愈创面中的血管再生。(3)通过同轴静电纺丝技术,制备出了内层负载二甲基乙二酰甘氨酸(DMOG)的复合纳米纤维。研究了该复合纳米纤维在高糖环境下对成纤维细胞的影响,包括对HIF-1α及其下游基因和修复相关基因的影响,并且通过进一步体内实验研究其对创面修复的调控作用。结果表明:内层负载了DMOG的复合纳米纤维支架能有效的在体外高糖环境下稳定HIF-1α的表达,并且促进相关基因表达的上调。动物实验表明,该复合支架在体内也能稳定HIF-1α的表达,促进创面的血管再生和再表皮化。综上所述,生物活性玻璃能通过促进巨噬细胞BMP-2的表达,激活肌成纤维细胞P38和SMAD信号通路,从而促进创面修复过程中肌成纤维细胞向脂肪细胞的分化,促进创面的愈合。进一步将生物活性玻璃和聚己内酯及Ⅰ型胶原复合制备出复合纳米纤维支架,证明该支架可以激活HIF-1α/VEGF信号通路,促进糖尿病创面中的血管再生,改善糖尿病创面中缺血的微环境。通过制备出同轴负载DMOG的复合纳米纤维,在体内外稳定HIF-1α的表达,刺激创面血管和表皮再生,从而促进创面修复。本论文阐明了生物活性玻璃促进创面修复的机理,并研究了多种纳米纤维基创面敷料促进难愈创面修复的作用及内在机理,对设计新一代高生物活性创面修复材料具有重要的指导意义。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08;TQ340.64
【图文】：

示意图,人体皮肤,组织结构,示意图

第一章绪论期间的组胺和血清素引起的。血管扩张促进血液流动创面也使更多炎症细胞进入创面区域。止血后，中性粒细胞进入创面部位，开始吞噬，清除异物、细菌和受损组织。作为炎症阶段的一部分，巨噬细胞出现并继续吞噬过程，同时释放更多的 PDGF 和 TGF- [12]。中性粒细胞有助于清洁创面，而巨噬细胞则可以清除病原体和碎片。此外，中性粒细胞还分泌有助于成纤维细胞和平滑肌细胞增殖的因子[13-14]。一旦创面部位被清除，成纤维细胞迁移进入创面部位，创面愈合进入增殖期并开始有新的细胞外基质沉积。新的胶原基质在最终重塑阶段变得交联并形成组织[15]。在这种有效和高度控制的修复过程中，细胞信号及细胞通路起到了重要的作用。

示意图,创面愈合,阶段,示意图

图 1-2 正常创面愈合阶段示意图[16]Fig. 1-2 The sequence of phases during normal wound healing[16]1.3.2 难愈皮肤创面修复创面愈合通常以即时、有序的方式进行，并且可以分为四个阶段：炎症、肉芽、再上皮化和组织重塑。当该过程中断时，将产生慢性难愈创面。慢性创面被定义为未能及时恢复功能和解剖学完整性的创面，或者在没有正常功能最终结果的情况下进行修复过程的创面[17]。绝大多数慢性创面分为三类：压疮，糖尿病溃疡和静脉溃疡。虽然这些创面的病因各不相同，但慢性创面的发展总是源于三个因素：老化、反复缺血再灌注损伤以及细菌污染导致炎症反应的细胞和全身效应[18-19]。大多数慢性创面对常规治疗反应良好；然而，在一小部分慢性创面患者（估计占所有慢性创面患者的 15％至 20％）中，尽管他们得到了最好的护理，但并未被愈合。虽然关于非愈合慢性创面的病因学有很多理论，但也存在相当一致的相似之处。通常，未愈合的创面显示生长因子（EGF，KGF，PDGF 和 IGF）减少，角质形成细胞迁移减少，活性氧（ROS）增加，组织蛋白酶增加

示意图,脂肪生成,示意图,激酶

图 1-3 BMP2 诱导脂肪生成示意图[53]Fig. 1-3 Schematic model of BMP2 induced adipogensis[53]p38 激酶上调 PPAR 的机制尚未明确。p38 激酶通过磷酸化直接上调 PPAR 是不的，因为 PPAR 在丝氨酸上仅具有一个 MAP 激酶的共同磷酸化位点，该位点被细信号调节激酶磷酸化，从而抑制转录[54]。PPAR 活性与此报告一致，我们证实了丝激活蛋白激酶特异性抑制剂 PD98059 增强 PPAR 和 BMP2 诱导的 C3H10T1/2 细胞生成的功能。另一种可能性是，PPAR 可能通过形成具有一定转录因子的复合物而。ATF-2 已知被 p38 激酶调控，并通过与其他转录因子或共激活物的串扰控制转们观察到 BMP2 在 C3H10T1/2 细胞中磷酸化 ATF-2[55-56]。因此，ATP-2 与 PPAR 的作用可能是由 p38 激酶上调 PPAR 的作用，尽管 ATF-2 和 PPAR 的相互作用，以及相互作用的生物学相关性是需要解决的。我们知道脂肪细胞在骨髓中与成骨细胞共有来源。有研究已经证实，BMP2 还通活 Smad 信号将多能间充质细胞分化为成骨细胞[57-58]。 BMP2 调节 PPAR 表达通

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