基于丝胶蛋白的抗菌材料及dsRNA递送载体的研究

发布时间：2020-08-02 21:33

【摘要】：丝胶蛋白(SS)是一种廉价易得的天然蛋白质,具有抗皱、美白、保湿、抗紫外、抗凝固、抗氧化性等特性,而且丝胶还具有良好的生物可降解性、生物相容性、促细胞粘附和促细胞增殖等生物活性。因此,丝胶蛋白是开发蛋白质生物材料的理想资源。然而,丝胶固有的脆性限制了其在生物材料领域的应用。本研究利用甘油和琼脂糖的先天优势,与丝胶蛋白复合制成具有良好力学性能的丝胶复合材料。对丝胶蛋白进行开发和再利用,探索其应用于组织工程与再生医学领域的可能性,为传统丝织产业的转型升级提供参考,具有重要的科学意义和现实意义。抗生素的滥用,造成许多耐药菌的产生,开发和应用能取代抗生素的新型抗菌剂是解决耐药性菌株产生的迫切需要。纳米银是一种高效的广谱抗菌剂,对细菌、真菌和病毒均具有抑制和杀灭作用,抑菌持久、高效、不会产生耐药性;溶菌酶,是一种专门作用于细胞壁的水解酶,是自然防御系统中一类重要的功能酶,对动物和人体安全,不会产生耐药性,目前应用最广泛的是来自鸡蛋清中的溶菌酶。核酸是治疗多种疾病的理想药物。常用的核酸递送载体包括病毒递送载体和非病毒递送载体。病毒载体的转染率高,但存在核酸装载量有限以及具有免疫原性和安全性风险等问题;非病毒载体安全、稳定,但仍然存在许多问题,如无机纳米颗粒载体不能被生物降解,阳离子脂质体价格昂贵,阳离子聚合物载体具有较高的细胞毒性和较低的转染效率。制备安全、高效的非病毒核酸递送载体是生物材料与医学交叉领域面临的挑战。本研究为拓展丝胶蛋白在抗菌材料及基因递送载体领域的应用提供了理论基础。取得了如下研究成果:1.原位绿色合成纳米银的丝胶蛋白复合膜通过添加安全无毒的塑化剂甘油,制备了具有良好力学性能和亲水性能的丝胶/甘油(SS/Gly)复合膜。对SS/Gly复合膜的力学性能、水接触角、吸湿率和保水率进行评估,结果表明添加甘油质量比为40%的复合膜亲水能力好,保水能力强,且具有优异的断裂伸长率和适中的抗拉强度。采用紫外辐射法辅助纳米银(AgNPs)在SS/Gly膜表面原位合成,扫描电镜结果表明AgNPs均匀分布在SS/Gly复合膜表面,而且随着紫外辐射时间的增加,合成的AgNPs数量增加。X射线光电子能谱证明复合膜表面上的银以零价的形式存在。抑菌圈和生长曲线实验结果表明AgNPs修饰的SS/Gly复合膜对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有优异的抗菌性能,其抗菌性能与紫外辐射时间呈正相关。电感耦合等离子体原子吸收光谱法结果表明AgNPs可以持续地释放到PBS介质中。该SS/Gly/AgNPs复合膜具有在抗菌材料如伤口敷料中的应用潜能。2.绿色装载溶菌酶的丝胶蛋白复合凝胶通过将丝胶蛋白与琼脂糖混合并冷冻干燥,制备了具有高孔隙率和高溶胀性能的丝胶/琼脂糖(SS/AR)凝胶。采用扫描电子显微镜、衰减全反射傅立叶变换红外光谱、X射线衍射、热重分析和溶胀率测试对SS/AR复合凝胶进行性能表征。采用绿色简便的溶液浸泡法,在SS/AR复合凝胶上成功装载了溶菌酶(LZM)。在丝胶/琼脂糖/溶菌酶(SS/AR/LZM)凝胶中,随着溶菌酶溶液浓度的增加,溶菌酶的装载量有所增加,但其装载率可能会降低。溶菌酶能从复合凝胶中释放出来,对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌发挥良好的抗菌活性,其对革兰氏阳性菌具有更强的抗菌活性。而且随着溶菌酶装载量的增加,其抗菌能力越强。SS/AR/LZM凝胶对NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)和HEK293(人胚胎肾细胞)细胞展现出优异的细胞相容性,能提高细胞活力。该复合凝胶具有在抗菌材料如伤口敷料中的应用潜能。3.自组装生成丝胶蛋白微球用于dsRNA的递送利用环境友好的自组装法,添加乙醇和冷冻诱导获得丝胶蛋白微球(SSMPs)。圆二色光谱、X射线衍射和傅立叶红外光谱实验证明了乙醇可诱导丝胶蛋白的二级结构由部分无规卷曲转变成β-折叠。当乙醇添加体积比为2%时,所得丝胶微球粒径较小(289.97 nm),大小均一。采用多聚赖氨酸进行修饰后的丝胶微球(SS-PLL MPs),表面电荷变成了正电荷,能与带负电的dsEcR发生静电相互作用,进而成功地装载dsEcR,并能保护其在10%胎牛血清(FBS)和RNA酶A中的稳定性,使其免受降解。用多聚赖氨酸修饰前后的丝胶微球对家蚕胚胎细胞(BmE)不仅没有毒性,而且能促进细胞的生长,具有优异的细胞相容性。在无血清和含10%FBS的培养基条件下,SS-PLL MPs能递送dsEcR至BmE细胞,有效沉默EcR、E74A和BR-C基因的表达,而且能够延长dsEcR干涉作用的时间至72 h。经评估,所制备的SS-PLL MPs与商用脂质体的干扰效率比较接近。SS-PLL MPs能成功地装载、保护和递送dsEcR,是一种有潜力的核酸递送载体,这为鳞翅目害虫的防治及基因治疗策略领域的研究提供了一定的基础。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08
【图文】：

示意图,丝胶,蚕茧,丝胶蛋白

图 1.1 从蚕茧中提取丝胶示意图[9]Fig.1.1 The schematic of sericin extraction from silkworm cocoon.胶蛋白的生物活性年来，丝胶蛋白因具有良好的生物学性质受到了国内外学者的广泛有大量便于交联和修饰的-OH、-COOH 和-NH2，亲水性好，可生物生物相容性和低免疫原性。此外，丝胶蛋白还具有保湿、抗菌、抗抗炎、抗凝血、抗癌以及促进细胞粘附和增殖等活性。

丝胶,丝胶蛋白

图 1.2 丝胶的抗氧化机制[3]Fig.1.2 The anti-oxidative mechanisms of sericin.胞增殖。Tsubouchi 等人[17]证明了丝胶蛋白能促进无血清培养基rada 等人[18]研究表明，分子量在 5～100 kDa 范围内的丝胶蛋白哺乳动物细胞培养，而且能增强人皮肤成纤维细胞的粘附。Ar现，丝胶蛋白的提取方法和浓度与能否促进细胞增殖相关，与的丝胶蛋白相比，热提取的丝胶蛋白的细胞活力最高；此外，L 的丝胶蛋白似乎能更好地促进细胞增殖和提高细胞活力，而L 的丝胶蛋白对细胞显示毒性，特别是通过尿素提取法获得的丝粘附性。有研究者发现丝胶膜能支持小鼠成纤维细胞（L-929）Noriaki 等人[21]研究发现丝胶能促进人眼角膜上皮细胞的粘附和伤口愈合，减小创面。然而，在家蚕基因中并未发现细胞的粘附，所以有研究者认为丝胶蛋白对细胞的粘附作用可能是因为个丝胶基因中具有重复序列[12]。丝胶对细胞的粘附机制还有待

生物医学应用,丝胶

第 1 章文献综述解材料。蛋白的应用研究 1.3 所示，因丝胶具有可生物降解性、高生物相容性、低免疫原湿、抗氧化、抗炎、抗凝血、抗癌以及促进细胞粘附和增殖等蛋白已被广泛应用于药物和化妆品行业中，并且在再生医学材发受到了学者们越来越多的关注[3, 4]。

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