两种含羟基磷灰石新型药物长效缓释骨材料的制备及生物学性能研究

发布时间：2020-08-07 23:43

【摘要】：目的和意义:药物缓释材料为骨与关节疾病的治疗提供新策略。本论文研究工作围绕两种具备长效药物缓释功能的羟基磷灰石(HA)复合骨材料的制备及生物学性能研究等方面开展。以化学接枝法和物理涂层法分别研制出长效缓释BMP-2活性肽P24的壳聚糖/羟基磷灰石仿生支架(CS-P24/HA)和超长期缓释rhIGF-1 的PLA/HA@Eu双层微球(PLA/HA(rhIGF-1)@Eu),重点研究了这两种具备长效药物缓释功能的HA复合骨材料分别对间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞的生物学性能影响,以及这两种材料分别对动物颅骨骨缺损、骨量丢失治疗效果。旨在促进骨组织工程载药缓释体系的发展,为进一步临床应用提供理论借鉴。方法:(1)采用化学接枝法制备缓释P24多肽的CS-P24/HA支架:以HA和CS(壳聚糖)为原材料,先对CS进行巯基化改性,再将P24多肽接枝到巯基化壳聚糖上,最后与HA复合,制备出仿生支架。研究该支架的体外缓释性能、理化表征,同时对材料的成骨性能及内在机制进行系列研究。(2)采用物理涂层法制备缓释rhIGF-1的PLA/HA(rhIGF-1)@Eu双层微球:以HA和PLA(聚乳酸)为原材料,先采用w/o/w法初步制备载rhIGF-1的PLA/HA微球,再采用Eudragit(丙烯酸树脂)涂层工艺,研制出具有“核-壳”结构的双层微球。研究该微球的粒径分布、体外缓释性能、表面形貌,将双层微球植入到成年雄性C57BL/6小鼠背部皮下,在6个月的实验周期内,初步探究该微球对小鼠骨量及软骨的生物学作用。结果:(1)CS-P24/HA支架能够在体外线性缓释P24长达90天。MSCs可以粘附在CS-P24/HA表面,并呈现良好的细胞形态。CS-P24/HA能够促进MSCs高表达成骨相关基因OCN、Runx2和COL-I,增加细胞ALP活性和钙盐沉积。在体内,CS-P24/HA能够促进材料植入部位的新骨生成,较好地修复大鼠颅骨骨缺损。(2)PLA/HA(rhIGF-1)@Eu微球能够在体外缓释rhIGF-1超过180天,在体外支持细胞表面粘附和生长,具备良好的生物相容性。将PLA/HA(rhIGF-1)@Eu微球植入小鼠背部皮下,在6个月实验周期内,微球组小鼠的骨量显著高于对照组,该微球能够对成年小鼠骨量带来有益作用。结论:(1)CS-P24/HA支架能够线性平稳缓释BMP-2活性肽,促进MSCs的粘附、增殖和成骨分化,具备良好的大鼠颅骨修复性能,是一种很有应用潜力的骨修复材料。(2)PLA/HA(rhIGF-1)@Eu双层微球能够超长期缓释rhIGF-1,该研究有助于了解IGF-1在骨矿化方面的生物学作用,是一种皮下局部应用药物缓释体系预防全身骨量丢失的新尝试。具备长效药物缓释功能的HA复合材料或可为骨与关节疾病的治疗提供新策略。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08;R68
【图文】：

骨组织,纳米,超微结构,结构示意图

轻基磷灰石（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，ＨＡ）是人体骨组织的主要矿物组成成分（约逡逑占６０°／。）。在骨组织中，纳米ＨＡ晶体呈片状（厚度２－５ｎｍ，长度１５－５５ｎｍ，宽逡逑度５－２５腿），镶嵌在Ｉ型胶原纤维中（图１－１），并按照一定顺序沿着胶原的长逡逑轴生长Ｗ。ＨＡ在骨组织工程支架、植入器械的表面改性、药物缓释等领域有逡逑着广泛的应用，已经取得了良好的社会及经济效益。ＨＡ的来源包括天然骨骼逡逑提取和人工合成两种途径Ｗ。从天然骨骼获取ＨＡ的步骤包括骨骼的清洗、高逡逑温煅烧及机械粉碎。其中，高温煅烧步骤耗时较长，能耗较高，而机械粉碎中逡逑的多级粉碎，步骤繁琐，需要球磨数十小时才能获得尺寸约为数百纳米的颗粒逡逑，生产效率尚待提高［６］，因此，目前该方法还没有真正进入应用领域。人工合逡逑成ＨＡ是目前较为通用的获取方法。逡逑１逡逑

直接压缩,支架材料,试验检测,多肽

ＣＳ－Ｐ２４／ＨＡ邋支架，分别记为邋ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ邋和邋ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ。为邋了研宄逡逑ＣＳ－Ｐ２４／ＨＡ体外缓释性能，验证支架能否实现Ｐ２４多肽的长效缓释，我们进行逡逑了高效液相色谱测试（ＨＰＬＣ），绘制出Ｐ２４多肽体外释放曲线。如图２－３所示，逡逑在体外释放测试周期内，未观察到明显的Ｐ２４多肽突释现象；ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ和逡逑ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ支架，能够持续、稳定地释放Ｐ２４多肽，释放周期超过９０天。逡逑此外，ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ和ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ支架中的Ｐ２４多肽释放特点为线性缓逡逑释，可根据零级动力学模型进行线性拟合（Ｒ２＝０．９９２９；邋Ｒ２＝０．９７５７邋）。逡逑ＣＳ－５°／0Ｐ２４／ＨＡ邋和在邋９０邋天的测试周期内，ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ邋和邋ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ邋两种逡逑支架材料的Ｐ２４多肽释放率相似。在每个测试时间点，ＣＳ－Ｉ０％Ｐ２４／ＨＡ支架的逡逑Ｐ２４多肽释放量略低于ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ支架。与ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ支架相比，逡逑ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ支架具有更高的Ｐ２４含量和较低的Ｐ２４多肽释放量

曲线,体外释放,支架,多肽

ＣＳ－Ｐ２４／ＨＡ支架的细胞相容性，我们将ｒＢＭ－ＭＳＣｓ接种到ＣＳ／ＨＡ、逡逑ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ和ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ三种支架上，共培养５天后，进行扫描电镜检逡逑测（见图２－４）。低倍ＳＥＭ图片显示，ＣＳ－Ｐ２４／ＨＡ支架孔隙丰富，呈现网状结逡逑构，孔隙率较高，提示支架材料多孔性能良好。通过中高倍ＳＥＭ图片，可观察逡逑支架微观形貌，材料表面粗糙，孔壁附着ＨＡ粉末，有利于ｒＢＭ－ＭＳＣｓ细胞的逡逑粘附，ｒＢＭ－ＭＳＣｓ邋能够较好地粘附在邋ＣＳ／ＨＡ、ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ邋和邋ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ逡逑材料表面，细胞呈现饱满的条索状形态。在细胞和材料共培养５天后，ＣＳ／ＨＡ、逡逑ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ和ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ支架表面均可以观察到多量的细胞生长，证逡逑实邋ＣＳ／ＨＡ、ＣＳ－５％Ｐ２４／ＨＡ邋和邋ＣＳ－１０％Ｐ２４／ＨＡ邋材料能够支持邋ｒＢＭ－ＭＳＣｓ邋的粘附逡逑和生长，提示ＣＳ－Ｐ２４／ＨＡ材料具备良好的细胞相容性。逡逑３９逡逑

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