二甲双胍提高tHA材料生物相容性促进牙周组织再生的机制研究

发布时间：2020-08-08 23:40

【摘要】：聚多巴胺模板化羟基磷灰石(polydopamine-templated hydroxyapatite,tHA)是一种以多巴胺为模板,仿生合成晶体结构的纳米羟基磷灰石生物材料,其晶体形态和化学组分与天然骨组织的微观结构接近,具有促进间充质干细胞成骨分化和骨组织缺损修复再生的效应。将tHA作为支架材料应用于牙周骨组织工程领域,具有巨大的研究价值。然而,研究发现高浓度的tHA会引起细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增高,ROS诱导的氧化应激损伤导致细胞活性和成骨能力降低。因此,提升tHA材料的生物相容性、防止氧化应激损伤、提高细胞活性和成骨能力是该材料在牙周组织工程应用中亟待解决的问题。据报道,治疗II型糖尿病的首选药二甲双胍(metformin,MET)具有抵抗氧化损伤、防止细胞衰老和凋亡的作用,这种作用可能与腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)信号通路诱导的自噬密切相关。自噬是细胞应对损伤、炎症、衰老的重要保护机制,细胞通过自噬能够清除过量的ROS以及被ROS损伤的细胞器和蛋白质,降低ROS对细胞的损伤,维持细胞正常的生理功能。此外,还有研究报导MET具有潜在的促进间充质干细胞成骨分化和增加矿化结节形成,以及辅助控制牙周炎症的作用。本研究将MET与tHA材料结合用于牙周组织工程研究,通过体外和体内实验,探讨是否能够利用MET促进自噬,提高牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)在tHA材料上的活性,并进一步促进细胞成骨分化和牙周骨组织修复再生。首先,本研究采用仿生法合成了tHA材料并对其进行理化性质表征。体外实验部分:用tHA联合MET培养h PDLSCs。通过检测细胞内ROS、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放、细胞凋亡周期、细胞增殖活性、细胞骨架染色评估细胞活性和材料生物相容性。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、钙结节茜素红染色、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因表达,评估牙周膜干细胞在tHA联合MET条件下的成骨分化效应。通过免疫印迹法(western blot,WB)分析自噬标志蛋白Beclin-1和LC3表达,以及AMPK/m TOR信号转导途径的磷酸化,阐明tHA联合MET诱导牙周膜干细胞自噬的机制。研究结果显示tHA联合MET显著减少h PDLSCs细胞内ROS积累,减少LDH释放,降低细胞凋亡和死亡率,提高细胞增殖活性,增强细胞骨架伸展和粘附。tHA联合MET明显提高h PDLSCs的ALP活性,增加矿化结节形成和成骨基因OCN、OPN和RUNX2的表达。tHA联合MET增强了自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表达,并且激活AMPK通路,同时抑制m TOR信号的转导。体内实验部分:建立SD大鼠下颌第一磨牙根方牙槽骨缺损模型,骨缺损处植入tHA与MET复合物,10周后收集样本,通过Micro CT进行术区骨组织三维扫描重建,通过钙黄绿素和茜素红荧光标记新骨形成。结果发现tHA联合MET能够有效促进缺损处新骨形成,提高骨组织矿化速度,对牙周骨组织缺损有显著的修复再生效应。综上所述,本研究结果表明MET能够改善tHA材料生物相容性,提高h PDLSCs在tHA材料上的活性,并协同促进成骨分化效应。tHA生物相容性的提高可能与MET经AMPK/m TOR信号途径诱导的自噬密切相关。此外,tHA联合MET在体内对大鼠牙周骨组织缺损有明显的修复再生作用。因此,tHA联合MET在牙周骨组织修复再生领域具有巨大的应用潜力。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.1
【图文】：

示意图,操作过程,示意图,超声分离

14图 1-2.3 tHA 生物材料的制备Figure 1-2.3 tHA synthesis：A 合成示意图；B 合成 tHA 操作过程2.4 tHA 材料理化性质表征2.4.1 TEM 观察将 tHA 粉末和一种传统的商品化羟基磷灰石 HA 进行 TEM 表征和对比。使用JEM-1400PLUS（JEOL，Tokyo，Japan）透射电子显微镜（TEM）观察两种纳米羟基磷灰石的形态。分别将 tHA 和传统 HA 粉末分散在乙醇溶液中，并超声分离。将悬液滴加到碳涂覆的铜网上，待干燥后在 TEM 下成像。使用 ImageJ 软件对 tHA

晶体形态,图像,微探针分析,尺寸分析

图像进行尺寸分析。2.4.2 XPS 分析使用 ESCALAB250XiX 射线光电子能谱仪（XPS）微探针分析 tHA 和传统 HA学元素组成。使用 Origin（OriginLab，Northampton，MA，USA）进行元素定析。果 tHA 材料晶体形态观察结果如图 1-3.1 所示，TEM 镜下见 tHA 晶体聚集成簇，呈现出海绵状结构（图 1）；传统 HA 晶体呈棒状结构，未见明显聚集（图 1-3.1B）。通过 Image J 软件 tHA 直径为 18.22±2.79nm，长度为 102.78±9.68nm。

晶体形态,化学元素,XPS分析

图 1-3.2 tHA 与传统 HA 化学元素 XPS 分析Figure 1-3.2 XPS analysis of tHA and traditional HA nanoparticles：A：宽光谱分析；B：高分辨率氮光谱分析4 讨论传统的 HA 通过化学沉淀或水热法等常规方法合成，这些方法需要苛刻的反应条件，如极高的温度或极端的 pH 值等，合成过程易产生有害物质[20]。此外，传统 HA 晶体的尺寸、形态和结晶度也与天然骨中 HA 晶体存在较大的差异。本研究合成的 tHA 利用 PDA 中的儿茶酚胺官能团螯合钙离子，并吸附磷酸根离子与氢氧根离子形成晶体成核中心，并不断沉积生长形成海绵状的最终的晶体形态。这种仿生合成法模拟天然骨组织中羟基磷灰石的生长发生过程，调控晶体矿化和生长方向，其形态结构更接近于天然骨中的羟基磷灰石[16][36]。[18]

【参考文献】