【摘要】：背景介入术后支架内再狭窄及支架内血栓形成是血管介入领域所面临的巨大挑战,目前新一代药物支架血栓发生率已降至0.2%,但再狭窄率仍未得到有效控制,严重影响介入术后患者的生存质量和远期预后,如何把支架内再狭窄和血栓形成风险降至最低始终是国内外介入器械研发的焦点与前沿领域。导师王显教授基于心脉病证络风内动病机理论,创新中药单体给药途径,将红豆杉、水蛭的单体成分紫杉醇、水蛭素组成络风宁0号方涂载于冠脉支架表面,制备出新型络风宁0号涂层支架用于心血管急症的中西医结合介入治疗。目前络风宁0号支架涂层复合物已拓展应用于药物球囊和可降解支架的研发,并在小型猪实验中初步证实其安全性及有效性,尤其在防治管腔再狭窄和血栓形成方面所凸显的优势更是令人振奋,但其微观生物学机制仍需深入探索。本团队既往研究发现,络风内动证患者体内处于高炎症状态,现代研究亦表明冠脉介入术后炎症微环境与支架内再狭窄和血栓形成密切相关,炎性活化的平滑肌细胞增殖迁移是再狭窄发生的关键环节,而抗炎在介入术后再狭窄的治疗中具备有效性,这给我们提供了启示,络风内动病机理论指导下的络风宁0号支架涂层复合物防治PCI术后再狭窄的效应机制可能与其对炎症微环境下血管平滑肌细胞的调控作用有关。进而我们从炎症角度切入,将目光锁定于经典的TLR4-MyD88炎症通路,以人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)作为研究载体,探究络风宁0号方对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响及可能机制,为下一步络风宁0号支架涂层复合物抗再狭窄的效应机制研究打开突破口。目的本课题利用脂多糖(LPS)诱导HCASMC炎性活化,观察络风宁0号支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4/MyD88/NF-κ B炎症通路的影响并寻找其作用靶点,从炎症角度探究络风宁0号支架涂层复合物抗支架内再狭窄的可能机制,为中药复合单体涂层支架/球囊的研发提供新思路。方法1、HCASMC的体外培养将购买的第二代HCASMC用无双抗培养基进行规范复苏、传代,建立第4～6代稳定的HCASMC作为后续细胞研究载体。2、建立LPS诱导HCASMC炎性活化细胞模型,最大化激活TLR4/MyD88/NF-κ B炎症通路2.1用MTT法摸索出LPS造模的无毒性浓度范围;2.2综合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法进一步筛选出LPS刺激HCASMC处于高炎性活化状态,且TLR4/MyD88/NF-κ B炎症通路关键位点及下游炎症产物的基因和蛋白表达均达到最大值的LPS浓度和刺激时间作为最佳造模条件,为下一步的络风宁0号支架涂层复合物的机制研究提供平台。3、探究络风宁0号支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响3.1用MTT法筛选出络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围,使细胞活力保持在90%以上;3.2综合利用ELISA、Q-PCR、Western blot法检测络风宁0号处理后TLR4/MyD88/NF-κ B炎症通路关键位点及下游炎症产物基因和蛋白表达的变化,初步锁定络风宁0号支架涂层复合物的抗炎作用位点。4、探索络风宁0号支架涂层复合物抑制LPS诱导HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的可能机制4.1设计HCASMC特异性MyD88 siRNA,利用脂质体转染法构建MyD88敲减细胞模型;4.2通过敲减MyD88或加入蛋白酶体抑制剂环氧酶素(Epoxomocin)选择性阻断MyD88降解,用 ELISA、Q-PCR、Western blot 法检测络风宁 0 号处理后 TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路关键位点及下游炎症产物基因和蛋白表达的变化,探索络风宁0号支架涂层复合物是否是通过作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88节点,影响蛋白降解途径而下调炎症反应,初步揭示络风宁0号支架涂层复合物的抗炎作用强度、作用靶点及分子机理。结果1、LPS诱导HCASMC炎性活化细胞模型的无毒性浓度范围低中浓度(0~10 μ g/mL)的LPS与空白对照组相比对HCASMC的活力无明显影响(细胞活力保持在90%以上),而高浓度(100μg/mL)LPS则对细胞活力产生影响(细胞活力80.1%),因此将LPS诱导HCASMC的无毒性浓度范围定为:0~10μg/mL。2、LPS诱导HCASMC炎性活化的最佳造模条件2.1 HCASMC 在不同浓度 LPS(0.01、0.1、0.5、1、10ug/mL)刺激 24h 后,在光镜下可见细胞数目呈剂量依赖性增加,其中LPS浓度为0.5、1、10 ug/mL时细胞增殖活跃。2.2 ELISA结果可见0.5和1 u g/mL LPS干预48h可同时激活HCASMC大量分泌IL-6,TNF-α和IL-1β,与空白对照组相比差异明显(P0.05)。2.3 Q-PCR结果显示1 u g/mL LPS干预48h可同时激活HCASMC上调TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-6,TNF-a和IL-1β mRNA表达,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。2.4 Western blot 可见 1 μ g/mL LPS 干预 48h 可同时激活 HCASMC 上调 TLR4,MyD88 和NF-κB p65蛋白表达。故1μg/mL的LPS干预HCASMC 48h能保证HCASMC处于持续的高炎性活化状态,最大限度激活TLR4-MyD88信号通路,可作为HCASMC炎性活化细胞模型的最佳造模条件。3、络风宁0号支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响3.1 MTT法筛选络风宁0号支架涂层复合物的无毒性浓度范围为:大浓度组1 μmol/L的紫杉醇+0.2mg/mL水蛭素(细胞活力保持在92%);小浓度组lμmol/L的紫杉醇+0.0125mg/mL水蛭素(细胞活力100%)。3.2 ELISA结果显示络风宁0号支架涂层复合物可下调炎性活化过程中IL-6,TNF-α和IL-1β蛋白表达量,络风宁0号大、小浓度组与炎性活化模型组相比差异有统计学意义(P0.05),其中大浓度组的抗炎作用更明显。3.3 Q-PCR结果显示络风宁0号大、小浓度组均可下调IL-6,TXF-a,IL-1 β,TLR4和NF-κ B p65的mRNA表达,与炎性活化模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05),但不影响MyD88基因表达(P0.05)。3.4 Western blot结果表明络风宁0号支架涂层复合物可下调炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表达。4、络风宁0号支架涂层复合物抑制LPS诱导HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的可能机制4.1 Q-PCR结果显示Epoxomicin不影响络风宁0号支架涂层复合物干预HCASMC后MyD88的基因表达(P0.05),高浓度Epoxomicin(1μM)可通过阻断MyD88降解的方式削弱络风宁0号支架涂层复合物对下游炎症因子IL-6,TNF-a,IL-1 β基因表达的抑制作用,与空白对照组及炎症模型组相比均有统计学意义(P0.05)。4.2 ELISA结果表明高浓度Epoxomicin(1 μM)可通过阻断MyD88降解的方式削弱络风宁0号支架涂层复合物对下游炎症因子IL-6,TNF-a,IL-1β蛋白表达的抑制作用,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.05),与炎症模型组相比差异无统计学意义(P0.05)。4.3 Western blot结果显示低、高浓度的Epoxomicin均可通过阻断MyD88降解的方式削弱络风宁0号支架涂层复合物对炎性活化后TLR4、MyD88和NF-κ B p65蛋白表达的抑制作用,其中高浓度Epoxomicin对络风宁0号抗炎作用的抑制强度更大。结论1、络风宁0号支架涂层复合物有抑制血管局部炎症反应的作用;2、络风宁0号支架涂层复合物通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路而起到抗炎作用;3、络风宁0号支架涂层复合物通过作用于TLR4/MyD88/NF-κ B通路中MyD88节点,促进MyD88蛋白在蛋白酶体途径降解,从而下调TLR4、NF-κ B p65活性,减弱LPS启动的以IL-1 β、IL-6、TNF-α为代表的炎症反应。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
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