3D打印复合梯度水凝胶支架的制备及其对软骨修复作用的研究

发布时间：2020-08-21 01:54

【摘要】：第一部分3D打印复合梯度水凝胶支架的制备及其相关性能的测试目的:探讨利用3D打印技术,制备包含明胶与羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)的复合材料梯度水凝胶支架以模拟正常软骨形态结构的可行性,并通过相关检测了解其结构形态、力学性质及生物相容性等特征。方法:(1)将A型明胶与甲基丙烯酸酐(Methacrylic Anhydride,MA)通过化学反应合成具有光敏性的甲基丙烯酰胺基明胶(Gelatin Methacrylate,GelMA),并将不同浓度的GelMA与HAP制备成混合溶液;(2)通过紫外光照成形的方法分别制备15%(w/v)GelMA、15%GelMA/3%HAP、30%GelMA、以及30%GelMA/3%HAP四种水凝胶支架;(3)对四种水凝胶支架的溶胀性能、力学性能、降解性能、及细胞相容性进行检测比较,根据结果选择最适合梯度支架的材料和浓度配比方案;(4)使用3D打印的方法制备复合材料梯度水凝胶支架(上层15%GelMA模拟软骨层,中间层15%GelMA/3%HAP模拟钙化软骨层,下层30%GelMA/3%HAP模拟软骨下骨层)以及其它4种非梯度支架,并对5种支架进行机械性能测试;(5)对梯度支架进行扫描电镜(SEM)观察,测量其孔径大小,通过观察支架表面骨髓间充值干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)粘附情况,测试该支架表面的细胞相容性;(6)使用qRT-PCR的方法,对BMSCs在梯度复合支架内的成软骨分化情况进行检测,并与非3D打印组进行比较。结果:(1)GelMA水凝胶的浓度从15%增加到30%时,支架溶胀率下降,两者差异有统计学意义(P0.05);与15%纯GelMA水凝胶相比,添加了3%HAP的混合水凝胶支架的溶胀率降低,两者差异具有统计学意义(P0.05)。(2)GelMA浓度从15%增加到30%时,GelMA水凝胶的杨氏模量明显上升,差异有统计学意义(P0.05);15%GelMA在混合了3%HAP后水凝胶的杨氏模量无明显变化(P0.05);30%GelMA在添加HAP后水凝胶杨氏模量降低,差异有统计学意义(P0.05)。(3)30%GelMA降解率低于15%GelMA,同样浓度的GelMA水凝胶,在混合HAP后,其降解率降低(P0.05)。(4)接种细胞72h后,15%GelMA水凝胶支架内细胞活性优于30%GelMA组(P0.05);在相同浓度的GelMA中混合3%HAP,对于水凝胶的细胞活性无明显影响(P0.05)。(5)3D打印复合梯度水凝胶支架的表面孔径为397.2±15.6μm;支架具有良好的细胞相容性,BMSCs可在其表面粘附并生长。(6)压缩模量测试显示3D打印复合梯度水凝胶支架的抗压缩性能优于单纯15%GelMA及15%GelMA/3%HAP的非梯度水凝胶支架(P0.05)。(7)qRT-PCR检测结果显示BMSCs在3D打印复合梯度支架内的成软骨分化能力优于非3D打印组(P0.05),提示复合梯度支架对于干细胞的成软骨分化有一定的促进作用。结论:低浓度GelMA水凝胶支架,具有良好的生物相容性,而随着浓度的增加,其生物相容性逐渐降低;30%的GelMA水凝胶支架,其溶胀性能、力学强度均优于低浓度(15%)GelMA组;将低浓度的HAP与GelMA混合,不会影响支架的生物相容性;通过3D打印制备的复合梯度水凝胶支架,能够较好地模拟正常软骨的形态特征,具有良好的生物相容性和力学特性,优于传统的纯GelMA非梯度水凝胶支架,并对接种其内部的BMSCs成软骨分化具有促进作用。第二部分3D打印复合梯度水凝胶支架对软骨损伤修复作用的研究目的:通过动物实验,探讨3D打印复合梯度水凝胶支架对动物软骨损伤的修复作用。方法:使用3D打印的方法制备两种不同的水凝胶支架(分别为:A组为复合梯度支架:上层15%GelMA、中间层15%GelMA/3%HAP、下层30%GelMA/3%HAP;B组:15%GelMA非梯度水凝胶支架)。选择18只新西兰大白兔,随机分为3组,在双膝股骨滑车中央制造直径3.5mm,深3mm的全层软骨缺损模型,并将制备的梯度支架与非梯度支架分别植入其中两组(A、B组)动物的软骨缺损区域,C组作为空白对照。术后第4周、12周每组各处死3只兔子并取材,首先对缺损区域行大体观察并采用ICRS评分比较;然后将标本制成切片,分别行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)、番红O、胶原II、固绿-番红O染色,结合O’Driscoll组织学评分对3组动物软骨损伤的修复效果进行比较。结果:与B组、C组相比,A组对于全层性软骨缺损具有更好的修复效果,其软骨下骨层修复组织与宿主组织接合紧密,形态更相近,部分切片可观察到软骨下骨层已基本愈合,并有钙化软骨层形成,但部分切片软骨修复表面仍有少量凹陷或高于周围软骨面。A组ICRS和O’Driscoll组织学评分在4周和12周时均优于其它2组(P0.05);B组在12周时两项评分均优于C组(P0.05)。结论:3D打印复合梯度支架在实验动物体内表现出了良好的生物相容性和可降解性;该支架可以通过原位压配的方式植入,实验结果证实其与软骨缺损处达到较紧密的结合,不易脱落;本次实验所设计的3D打印复合梯度水凝胶支架,具有较好的促进软骨修复和软骨下骨形成的作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

关节软骨,复合梯度

3D 打印复合梯度水凝胶支架的制备及其对软络中，嵌入了由蛋白多糖和糖蛋白的凝胶样结构，从[11]。据其形态特征和结构组成的差异，可分为四个区域，骨深层和钙化软骨层[12]。如图 1.1 所示，每个区域均每个区域内 ECM 组成成分和比例的不同，使软骨各所差异。

拉伸曲线,拉伸实验,拉伸试样

图 2.2 拉伸实验图及哑铃形拉伸试样图将制备的样品放置于力学试验机 ElectroForce（TA Instruments, 美国）上进行单轴拉伸试验，拉伸速率设置为 1mm/mim，拉伸的初始长度为 5 mm，拉伸过程中详细并记录实验数据。在拉伸曲线的 0-10%的形变处取斜率，得到样品的杨氏模量。每组设置 6 个平行样本。6、水凝胶降解性能测试方法①将上文所述的四组水凝胶制备成圆柱样品（厚 4 mm，直径 12 mm）；②所有样品冻干后称重，得到初始重量 Wi 并记录；③使用 PBS 溶液将冻干后的样品浸没 24 小时使其充分溶胀，之后加入浓度为 2.5U/mL 的Ⅱ型胶原酶 2 mL，并将其置于转速为 130 转/分、温度为 37 ℃的恒温摇床中震荡；

水凝胶,内细胞,生长情况,标尺

-33-c d图 2.6 0h 细胞在各组水凝胶内细胞生长情况（从 a-d 依次为 15、15+3、30、30+3，图片标尺为 100μm（参照 d））图:2.7 是水凝胶固化后 72h 时细胞的活性染色图，从图上可以看出 30 和 30+3 组死亡细胞数量较 0h 时明显增多，而 15 和 15+3 的水凝胶内部的死细胞数量与 0h 时无明显变化。除此之外，我们可以发现 15%、30%的 GelMA 与其对应浓度添加混合3%HAP 的水凝胶相比，其死亡细胞数量大体相当。据此，我们推测纳米 HAP 的加入对于复合水凝胶的细胞相容性无明显影响。

【参考文献】