多巴胺改性丝蛋白膜皮肤创伤修复功能的研究

发布时间：2020-08-22 19:35

【摘要】：皮肤组织工程近年来发展迅速,其中利用敷料治疗损伤皮肤能够加快伤口的愈合和功能性恢复。蚕丝蛋白是一种天然的生物高分子,具有良好的物理化学特性,而且能够加工成膜、凝胶、海绵支架及纳米纤维等。此外,蚕丝蛋白具有良好的生物相容性和抗氧化、抗菌等特性,能够促进创伤组织再生,作为皮肤创伤修复的生物医用材料受到更多的关注。目前创伤敷料对材料的细胞相容性和初期黏附性能均具有较高要求,因此,如何提高蚕丝蛋白材料的细胞相容性是优化其在皮肤组织工程应用的关键。本研究,首先制备蚕丝蛋白膜,包括家蚕丝素纳米纤维膜和柞蚕丝素膜,然后在其表面进行多巴胺生物改性,大幅提高其细胞黏附性能,最后通过动物全层皮肤创伤模型,验证其优良的皮肤创伤愈合效果。本论文主要研究内容包括以下3部分:(1)多巴胺表面改性丝素纳米纤维膜的制备及其皮肤修复功能首先,利用静电纺丝技术制备丝素纳米纤维,通过调节纺丝液浓度、电压、接收距离及纺丝液流速等参数,选择最佳纺丝条件为浓度7.5%,电压24KV,接收距离12cm,纺丝液流速0.02mL/min,获得直径约400nm的丝素纳米纤维;再通过2mg/mL的多巴胺反应液进行共培养,对丝素纳米纤维进行表面改性,并用SEM和XPS进行验证。纳米纤维表面附着多巴胺颗粒及其N/C摩尔比接近聚多巴胺理论值证实了多巴胺改性成功;通过持久性测试,发现多巴胺改性涂层能够持续7天;接触角测试和蛋白吸附实验证明,多巴胺改性后的丝素纳米纤维膜亲水性和蛋白吸附量均有所增加,为细胞黏附提供理论基础;在纳米纤维膜表面培养L929细胞,结果表明多巴胺改性后的丝素纳米纤维膜显著提高细胞的初期黏附和铺展性能,同时也提高了细胞的增殖性能;最后,SD大鼠全层皮肤创伤实验证明,多巴胺改性丝素纳米纤维膜提高创伤愈合速度和创伤组织上皮化,成功促进创伤修复。(2)取向型丝素纳米纤维的制备及其诱导干细胞成血管分化研究为提高丝素纳米纤维的力学性能,在制备丝素纳米纤维的基础上,于纺丝液中添加四氧化三铁纳米颗粒,再通过磁场收集装置,利用磁场叠加电场的作用,制备取向型丝素纳米纤维膜;通过SEM可以观察到添加质量分数0.3%的四氧化三铁纳米颗粒,纺丝30min时能够获得较好取向的丝素纳米纤维膜;通过FTIR分析,发现添加0.3%的四氧化三铁纳米颗粒不影响丝素纳米纤维的二级结构;同时,力学性能测试,发现取向型丝素纳米纤维在其取向方向上具有较高的拉伸强度和弹性模量,这为材料力学性能接触引导提供基础;而且,通过振动样品磁强计测试发现,添加少量的四氧化三铁纳米颗粒赋予了丝素纳米纤维一定的磁响应性;间充质干细胞培养结果表明,取向型丝素纳米纤维能够诱导细胞取向生长,并且在基础培养基条件下向成血管方向定向分化;最后,我们利用取向丝素纳米纤维膜培养成肌细胞C2C12,发现其同样能够引导细胞随取向方向生长,为其在皮肤深层创伤肌肉修复方面的应用提供基础。(3)多巴胺改性柞蚕丝素膜的制备及其皮肤修复效果为进一步提升创伤敷料的细胞相容性,我们创新性的利用含有RGD多肽序列的柞蚕丝素作为研究材料。首先制备柞蚕丝素膜,利用多巴胺改性柞蚕丝素膜8h和16h,通过AFM原子力显微镜观察,结果显示随多巴胺改性时间增长,柞蚕丝素膜表面的多巴胺颗粒逐渐增多,表面粗糙度增加,其多巴胺涂层厚度与反应时间成线性关系;XPS测试证明,多巴胺改性后的柞蚕丝素膜表面N/C摩尔比接近聚多巴胺理论值,证明多巴胺成功改性;接触角测试证明,多巴胺改性后的柞蚕丝素膜表面亲水性增强;通过Zisman方法计算,多巴胺改性后的柞蚕丝素膜表面自由能从20.61 mJ/m2增加至39.95 mJ/m2,而且蛋白吸附能力显著性增强;在多巴胺改性后的柞蚕丝素膜上培养间充质干细胞发现,多巴胺改性后的柞蚕丝素膜促进了细胞的黏附和增殖行为;同时,通过细胞划痕实验,可以证明多巴胺改性后能够促进干细胞向划痕处迁移,这对诱导创伤部位修复细胞的迁移从而促进创伤愈合是非常重要的;最后,SD大鼠全层皮肤创伤模型实验证明,相比未改性柞蚕丝素膜和商用纱布,多巴胺改性柞蚕丝素膜能够加快创伤愈合速度,同时促进创伤部位胶原蛋白的分泌,以及促进皮肤附属器官毛囊和汗腺的再生,这对皮肤功能性恢复具有重要意义。本研究通过多巴胺改性蚕丝蛋白膜,包括丝素纳米纤维膜和柞蚕丝素膜,显著提高其细胞相容性和细胞黏附特性。这为蚕丝蛋白在皮肤创伤修复领域的应用研究拓展思路,拓宽了蚕丝蛋白生物材料的应用范围。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

治疗策略,生长因子

其中主要包括细胞－细胞相互作用、细胞－细胞外基质相互作用、逡逑生长因子－细胞外基质相互作用以及生长因子－生长因子相互作用，是一个复杂多逡逑因素作用的结果［２６，２７］。如图１．３所示，目前创伤治疗的策略包括靶向药物治疗，逡逑如抗炎药物、抗凝血药物和抗血小板药物；干细胞疗法，将自体或异体干细胞种逡逑植在创伤处，从而加快创伤愈合，减少瘢痕挛缩［２８］；基因治疗，是指通过ＤＮＡ逡逑重组技术，将目的基因导入载体表达，获得对创伤愈合有益的生长因子或蛋白［２９］。逡逑此外，研究证明适当剂量的机械力刺激或电刺激能够促进多种生长因子的分泌及逡逑表徸，促进肉芽组织及成纤维细胞的增殖和分化［２９，３（）］。近年来，组织工程材料逡逑在皮肤修复方面的应用研究愈来愈多，通过将种子细胞附着在可降解生物材料表逡逑面，植入创伤部位，材料被降解吸附的过程中新的皮肤组织形成，由此达到修复逡逑创伤的目的［３１＿３４］。逡逑悐藤１逡逑Ｎａｎｏｔｌ邋ｂｒｏｉｌｓ逦＿逡逑Ｓｃａｔｈ．ｌｄｓ逡逑Ｖ逡

特性图,伤口敷料,特性,生长因子

复合支架,支架,成纤维细胞,明胶复合膜

制备ＰＥＧ／明胶复合膜敷料，具有明显的抗菌性能，而且相比传统敷料能够更快逡逑的促进皮肤创伤愈合。Ｃｈｅｎ等学者ｆｉｅ７：ｌ利用编织技术将ＰＬＧＡ多孔编织网与肢原逡逑蛋白复合，结构如图１．６所示，在ＰＬＧＡ网孔间形成肢原多孔支架结构。该支架逡逑结构提高了成纤维细胞的黏附量，促进成纤维细胞的生长，加速了类真皮结构的逡逑１２逡逑

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