多层平板型人工肝脏膜材料制备及性能

发布时间：2020-08-23 19:29

【摘要】：人工肝支持系统是肝衰竭患者等待供肝移植的一种重要过渡手段。多层平板型人工肝是生物型人工肝的一个研究热点,而多层平板型人工肝的生物反应器中用于细胞黏附和维持并发挥功能的膜材料是其中的研究重点。聚氨酯(Polyurethane,PU)材料本身具有良好的物理机械特性和生物相容性,但聚氨酯材料的疏水性限制了其在细胞培养方面的应用。为提高肝细胞在材料表面的亲和性,本课题对PU膜表面进行氨基化改性和丝胶接枝修饰。用红外光谱、拉曼光谱、水接触角测试、原子力显微镜和扫描电镜等方法对PU、表面氨基化改性聚氨酯(PU-NH_2)和丝胶接枝聚氨酯(PU-SS)膜片表面化学基团、膜片分子结构、亲疏水性、表面粗糙度和表面形貌进行表征。将L02和HepG2细胞分别接种于PU、PU-NH_2、PU-SS膜片表面,用细胞培养板(TCPS)作为对照组,比较细胞在各表面上的生长增殖和分泌功能,评价PU、PU-NH_2、PU-SS膜片的细胞相容性。并根据国家医用材料安全性标准对PU、PU-NH_2、PU-SS膜片进行体外细胞毒性评价和血液相容性评价。实验结果表明:PU表面氨基化改性在材料表面引入了氨基基团,使PU膜表面粗糙度从8.8±6.3nm增加到55.4±28.1nm,水接触角从90.9±0.3°降低到62.7±0.7°。PU-SS表面粗糙度和亲水性与PU-NH_2表面无显著性差异。L02和HepG2细胞在PU-SS表面完成贴壁的速度显著高于PU-NH_2、TCPS和PU表面(P0.01);L02细胞在PU、PU-NH_2和PU-SS膜片表面铺展不充分,与TCPS表面有明显差异。L02细胞在各表面上的增殖速度存在显著性差异:TCPSPU-NH_2/PU-SSPU;但L02细胞在PU-SS表面上白蛋白和尿素氮分泌总量显著高于PU和TCPS表面。HepG2细胞在PU、PU-NH_2和PU-SS膜片表面的生长形态与TCPS表面未体现出明显差异,MTT法测HepG2细胞培养5天后的细胞相对数与PU无显著性差异。但HepG2细胞在PU-SS表面上细胞的蛋白合成能力和白蛋白分泌总量显著高于其他表面。PU、PU-NH_2和PU-SS膜片浸提液无体外细胞毒性。膜片血液相容性符合国家生物材料安全标准,PU-NH_2和PU-SS表面有更低的溶血率(0.3±0.5%、-0.2±1.4%)、抗凝血指数(85.0±1.0%、85.0±1.0%)和血小板消耗率(5.1±1.1%、3.3±2.5%)。综上所述:PU表面氨基化改性和丝胶修饰影响材料表面的润湿性和粗糙度。使细胞与其表面接触面积增大,提高了细胞的粘附性,更利于细胞黏附、铺展和增殖。本课题制备的膜片均能支持细胞的黏附生长和功能,L02和HepG2细胞在PU-SS表面能同时满足快速贴壁、单位时间内有较大细胞数量和较高细胞功能的条件;生物材料安全性实验也证明PU-SS膜有成为多层平板型人工肝脏膜材料的潜力,有望在多层平板型人工肝支持系统中得到应用。
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R318.08
【图文】：

肝脏细胞,结构示意图,肝细胞

素[30]。由图1.1可知，肝细胞在体内是多面体形的立体结构，而在体外培养时，肝细胞通常会在培养基质表面过度铺展增殖而失去其在体内的大部分功能[31]。体外培养肝细胞的重要问题是如何达到体内肝细胞解毒、分泌、合成和生物转化的功能，研究者们构建出许多肝细胞培养模式，如“三明治夹心”培养[32]、微囊包裹培养[33]、细胞共培养[34]、球形聚集培养[35]等。FMB-BAL[32]是一种典型的“三明治”多层平板生物反应器，采用胶原/肝细胞/胶原的“三明治”夹心培养技术提高了反应器平板材料上肝细胞的黏附铺展，并在18天内维持功能。肝细胞在海藻酸钙凝胶珠内能够长时间保持增殖，并持有合成能力和代谢解毒能力[36]。但微囊包裹培养体系细胞稳定性差，微囊工作直径尚存在争议，其临床应用受到了一定限制[37]。Kim等[34]将肝细胞片（HEP片）夹在两个内皮细胞（EC）片之间，制成具有肝细胞特异性和极性的三层肝组织。成功模拟了体内环境肝细胞的异质性

技术路线图,技术路线,膜片

方式实现高度集成肝细胞三维培养的优势，对多层平板型人工肝脏所使用的膜材料进行研究。采用生物相容性良好的聚氨酯为膜基材，并对医用聚氨酯膜片进行表面修饰制得改性膜片，具体研究内容如下:(1)聚氨酯膜材料制备及表征：聚氨酯颗粒成膜；聚氨酯材料表面氨基化；材料表面丝胶修饰（EDC/NHS 交联）；红外光谱测试膜片表面基团变化情况；拉曼光谱测试膜片分子结构的变化情况；扫描电镜观察膜片表面形貌；AFM 原子力显微镜测定膜片表面粗糙度变化；水接触角表征材料表面水的润湿性。(2)分别将 L02 细胞和 HepG2 细胞接种于对 PU、PU-NH2和 PU-SS 膜片表面，以细胞培养板为对照实验组，对细胞在各表面上的黏附、生长增殖和细胞功能进行研究，评价膜片表面的细胞相容性。同时分析比较膜片表面物理性质（表面形貌、粗糙度）和表面化学性质对细胞的影响。(3)根据国家标准对膜片进行浸提液细胞毒性实验，血液相容性实验：溶血率、抗凝血指数及血小板黏附率，考察膜片的生物安全性。1.5.3 本课题的技术路线

示意图,丝胶,氨基化,修饰反应

将 100 片 PU 膜片加入到 200ml 质量分数为 7.5%的 MDI 的甲苯溶液中，入质量百分比为 2.5%的三乙胺作为催化剂，氮气保护下机械搅拌，60℃ 2.5h。反应结束后将膜片取出，依次用甲苯、无水乙醇超声清洗各三次，面异氰酸酯化的膜片（PU-NCO）。表面异氰酸酯化的膜片加入到 200ml 质量分数为 2%的乙二胺的甲苯溶60℃反应 3h。反应结束后将膜片取出，依次用甲苯、无水甲醇、去离子清洗各三次，得到表面氨基化的聚氨酯膜片（PU-NH2）。3.3 丝胶接枝 PU 表面的制备别配制浓度为 0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、1%的 SS 溶液 30m SS、EDC、NHS 质量比为 3：3：1 的比例将 EDC 和 NHS 添加到丝胶蛋中，活化丝胶羧基 20min，加入 5 片表面氨基化聚氨酯膜片（直径为 34mm） 37℃反应 24h。反应结束后将膜片取出，用去离子水和 75%酒精超声清洗备用。

【相似文献】