不同结构纳米纤维支架对骨髓间充质干细胞行为的影响及其机制研究

发布时间：2020-08-25 14:39

【摘要】：椎间盘退变性疾病是一种严重危害人类健康的疾病,可引起神经压迫和损害,其导致的腰背痛是目前造成劳动力丧失的主要原因。椎间盘退变性相关疾病的治疗方法很多,包括功能锻炼、药物治疗、物理治疗和手术等,保守治疗无效时最终选择仍是手术治疗。切除突出的椎间盘组织和椎间融合手术是传统的手术方式,但存在难以恢复运动荷载的问题,从而导致患者功能恢复差。植入人工椎间盘或人工髓核能有效复原椎间盘高度,从而部分恢复椎间盘的解剖和运动功能,改善术后患者的生活质量。然而,目前植入的人工椎间盘和髓核的材料还存在缺陷,与周围组织相融效果不佳,可能使植入物脱出或移位,从而导致并发症的发生。组织工程和再生医学策略在解决上述问题中体现出显著的优势,组织工程技术可在仿生天然纤维环中制作出类似人体胶原纤维结构,静电纺丝技术可以制成接近自然解剖特点的组织工程纤维环组织,而且能有效地促进植入物周围组织再生,使植入物与周围组织融合为一个整体,从而部分解决骨与临近纤维环组织整体性的问题。然而,上述技术制成的组织工程纤维环还不完善,目前无法应用于临床。面临的主要问题包括静电纺丝技术制成的纤维环支架材料,细胞难以长入支架内部,且难以诱导种子细胞向内外层纤维环细胞定向分化,并且由于分化机制不明,难以定向调控。聚已内酯等材料等类似纤维电纺产品强度不够,某些产品降解速率不可控,并且其促进组织再生的机制尚不明确。为了研究能应用于椎间盘突出临床实践的组织工程仿生材料,本课题组前期对聚乳酸/聚已内酯(Poly(L-Lactide)/Polycaprolactone,PLLA/PCL)材料进行了研究,结果显示这种材料具有优良的力学性能、有效的表面活性与降解速率可调控性等优势。为了继续深入研究和优化支架材料,使之向临床应用进一步推进,我们对PLLA/PCL材料配置比例及制作方法进行了改进,制备了的三种不同结构的纳米纤维材料进行了比较研究,优化了细胞长入条件,并探索了不同结构材料促进组织再生的可能机制。本研究中,我们首先制备了纳米纱(Aligned Nanoyarn/Nanofibrous Scaffold,AYS)、取向纳米纤维支架(A1igned Nanofibrous Scaffold,AFS)和三维多孔纳米纤维支架(Three-dimensional porous Nanofibrous Scaffold,3DPS)3种不同结构的纳米纤维材料,随后将大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cell,BMSC)体外接种至这3种材料中,检测BMSC在支架材料中黏附、生长、增殖和细胞活性;将AYS、AFS、3DPS材料种植于大鼠皮下,观察囊壁厚度、异物巨细胞的形态数目,检测炎性因子基因表达水平,评价三种材料的生物相容性;比较普通培养方法、间歇离心法以及生物反应器动态培养法培养BMSC的效果,观察细胞存活、生长和分布情况,优化体外培养方法;体外静态培养BMSC,观察细胞在三种纳米纤维支架中的形态、黏附、增殖、分化等行为,比较纤维环细胞相关表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表达水平和细胞内FAK信号通路相关蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38表达水平,评价不同结构纳米纤维支架促进BMSC增殖分化的效果,并初步探索不同结构支架材料促进BMSC增殖和诱导分化的机制。通过本研究,我们发现AYS、AFS和3DPS三种纳米纤维材料均具有良好的生物相容性;相对于普通培养法和间歇离心法,生物反应器灌注培养法能更好地促进大鼠BMSC长入;不同结构的支架中,BMSC的细胞黏附、增殖、定向分化行为有显著差异,AYS材料中,BMSC倾向于分化为成纤维细胞,3DPS材料中,BMSC倾向于分化为类软骨细胞;在不同结构支架中的BMSC的Aggrecan、Sox-9基因表达量也有显著差异,FAK信号通路相关蛋白AKT、P38表达水平有显著差异,提示可能通过Integrin-FAK信号通路发挥促进增殖和诱导分化的作用。本研究深入研究了AYS、AFS、3DPS三种组织工程支架材料对BMSC行为的影响,并对其促进细胞增殖和定向分化的机制进行了初步研究,有助于进一步优化纤维环组织工程支架产品,推进后续研究。第一部分纳米纱/多孔纳米纤维组织工程支架材料生物相容性研究目的:通过体内外实验评价取向纳米纱(AYS)、取向纳米纤维支架(AFS)、三维多孔纳米纤维支架(3DPS)材料的生物相容性。方法:聚乳酸(PLLA)、聚已内酯(PCL)和明胶按不同比例配置通过静电纺丝技术制备成取向纳米纱(AYS)。聚乳酸(PLLA)和明胶混合采用常规静电纺丝技术制作无规纳米纤维,通过改变接收装置,制备取向纳米纤维支架(AFS)。无规纳米纤维再经过匀浆/冻干成型制成三维多孔纳米纤维支架(3DPS)。将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)接种于上述支架材料。体外培养后检测细胞在支架材料中黏附、生长情况、增殖、活性,评价体外生物相容性。将三种支架植入大鼠皮下,在不同时间点取材,通过组织学染色、免疫组化、测量囊壁厚度、异物巨细胞的形态数目及炎性因子基因表达量,评价体内生物相容性。结果:体外实验表明骨髓间充质干细胞均能在三种材料上黏附、增殖,生长良好。体内实验表明三种材料在体内早期(1-2周)均有较轻程度的炎性反应,4周后炎细胞浸润减少,异物巨细胞数量逐渐减少。炎症因子基因表达量趋势与炎细胞浸润相符。结论:体内外实验结果证实该支架材料具有良好生物相容性,为进一步开发纤维环组织工程支架材料应用奠定基础。第二部分骨髓间充质干细胞在支架材料中长入条件的优化目的:对比普通培养法、间歇离心法、生物反应器动态培养法三种不同培养条件下细胞生长存活情况,从而优化培养方法。方法:将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)接种于取向纳米纤维支架(AFS)、取向纳米纱(AYS)、三维多孔纳米纤维(3DPS)支架材料,分别采用普通培养方法、间歇离心法以及生物反应器动态培养法进行培养。培养7、14天后,取出支架进行如下检测:HE染色观察细胞在支架材料中生长情况;DAPI检测细胞分布、活性;测量细胞长入深度。结果:证实生物反应器灌注培养法细胞能更好地长入支架材料内部,且存活良好。结论:生物反应器灌注培养的动态培养方法更有利于细胞长入支架内部,且细胞存活良好。第三部分不同结构纳米纤维支架对骨髓间充质干细胞行为的影响及其机制研究目的:比较细胞在不同结构支架材料上的细胞形态以及黏附、增殖、分化等行为的差异;比较不同支架内纤维环细胞相关表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表达水平以及支架内BMSC细胞中FAK信号通路相关蛋白表达差异。明确支架结构对细胞行为的影响,阐明其可能机制。方法:将前期制备的三种支架材料消毒后备用。在体外将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)接种于三种不同结构支架内,静态培养3周后比较BMSC在三种纤维支架中细胞形态以及黏附、增殖、分化等行为的差异;提取细胞中cDNA,qRT-PCR测定关键表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表达水平。通过Western blot对支架内BMSC中相关蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38含量表达进行检测。对比不同结构支架对细胞行为的影响。结果:表明不同结构支架对细胞黏附、增殖、定向分化等细胞行为具有明显影响,在取向性一致且致密结构的支架内细胞形态类似成纤维细胞,且细胞外基质I型胶原含量更高,细胞更易向成纤维细胞方向分化,而在三维多孔不规则形态材料中,细胞形态多呈圆形,且细胞外基质II型胶原含量更高,PCR测定Aggrecan、Sox-9基因表达量显著高于AFS、AYS组,细胞倾向于向类软骨细胞分化。FAK信号通路相关蛋白AKT、P38表达水平有显著差异。结论:证明不同结构支架形貌可直接影响细胞行为。支架结构调控细胞行为可能是通过Integrin-FAK信号通路机制发挥作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R318.08
【图文】：

局部放大图,平均体重,周龄,颈椎

图 1 A 为 AFS，B 为 AYS，C 为 3DPS，D 为 3DPS 局部放大图标尺为 100um（五）BMSC 的获取与鉴定取 3 周龄大小的 SD 大鼠，平均体重约 100g，采取颈椎脱臼法处死，75%酒精溶液中浸泡 5min，在无菌条件下取出股骨和胫骨，显露髓腔，用 DMEM 培养液（低糖）轻柔冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液，离心机设定转速 1000r/min 离心 5min，弃去上清，用 DMEM 洗 2 遍，重新悬浮于 DMEM 培养液中（含 10%胎牛血清）。置于细胞培养箱内常规培养。24h 后更换新鲜培养液。当原代细胞铺满培养瓶底面积约 70-80%时，按 1:2 的比例传代。弃原培养液，PBS 溶液洗涤 2 次。胰蛋白酶消化液消化 2min，待原贴壁的呈纤维状的细胞逐渐收缩变圆时，立即加入含 10%FBS的 DMEM 终止消化。将贴壁的细胞轻柔吹打成悬液，1000r/min 离心 5min 后收集消化所得的细胞，各取一半分别收集于两个培养瓶中，加入低糖 DMEM 培养液（含10%胎牛血清），置 37℃，5%CO2 的 CO2 培养箱内继续培养。取第 3 代 BMSC，胰酶消化，PBS 溶液清洗，离心 5 分钟（1000 转/min），抽取上清悬液，弃之。离心管底部细胞加入含 3% 胎牛血清的 PBS 溶液，轻轻吹打，

正态分布,骨髓间充质干细胞,流式

6、囊壁厚度检测分别于 1、2、4、8 周取出支架，固定切片，HE 染色后，测量包裹支架囊壁厚度，每个时间点每种材料测量 9 个典型视野囊壁厚度。囊壁厚度反映炎症程度。(八)统计学处理采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析进行处理，两两比较采用 LSD-t 检验进行分析处理；不满足正态分布和方差齐性时，则采用非参数检验进行分析处理。计数资料以数值或百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验进行处理，P<0.05 时认为差异具有统计学意义。三、结果（一）BMSC 分离及鉴定结果1、流式细胞仪检测结果

成骨,细胞形态

图 3 BMSC 细胞形态及成骨、成脂分化。A 为 BMSC 形态；B 为成骨分化；C 为成脂肪分化由图 3 可见 BMSC 细胞形态呈长梭形，均一性好。B 图可见细胞排列为多层，呈铺路石样，相互间重叠，细胞内部矿化，可见含有大量矿盐沉积，形成钙化结节。茜素红染色显示矿化结节呈红色。具有成骨分化能力。C 图可见明显大小不等的脂滴空泡形成，被油红 O 染成特异性橘红色，具有成脂分化能力。（二）体外生物相容性1、细胞黏附不同支架上骨髓间充质干细胞（BMSC）的粘附情况如图 4。由图可见共培养2h、4h、8h 和 16h 后，CCK-8 法检测实验三组支架 BMSCs 细胞粘附随时间延长有所增加。与取向纳米纤维相比，细胞在取向纳米纱及三维多孔纳米纤维材料粘附率更高一些；4h 时 AFS 组 OD 值为 1.529±0.02，AYS 组为 1.625±0.04，3DPS 为

【参考文献】