近共振增强的高分辨受激拉曼显微成像及应用研究

发布时间：2020-09-04 17:31

　　无标记光学显微成像技术已成为生物医学研究的重要组成部分。然而,由于光学衍射极限的限制,能应用于细胞或组织的超高分辨成像技术仍面临巨大挑战。基于荧光标记的显微成像技术可以通过对外源标记分子的操控,间接实现包括蛋白质、核酸在内的多种生物分子的特异性超分辨成像。但是荧光标记分子通常较大,会干扰对细胞性质的研究。当前,能够直接探测固有生物分子,产生图像对比度的无标记高分辨显微成像技术有了飞速的发展。例如自发拉曼光谱成像技术已经开始广泛应用于生物系统的生化分析和成像,但是自发拉曼的采集速度相对较慢,分辨率以及灵敏度都有待进一步提高。随着技术的发展,受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering,SRS)显微成像技术逐渐成熟,该技术对生物体的成像速度更快,灵敏度更高。然而,SRS作为一种无标记分子振动成像技术,其空间分辨率一直被限制在300纳米左右。因此,能够突破180纳米传统空间分辨极限的无标记超高分辨光学成像一直是成像领域开拓的重要方向。本文将探讨横向分辨率接近130纳米的近共振增强无标记受激拉曼散射显微成像技术,其高分辨率图像的对比度直接来源于低浓度的内源性生物分子。通过双波长倍频技术,本文首次实现了基于可见光波段的SRS成像系统。相比于近红外SRS,可见光SRS过程中,分子被泵浦光所激发到的虚态更加接近上一级电子激发态,因此,该过程中的拉曼散射截面更大,成像灵敏度相比传统SRS显微镜提高了约23倍。此外,我们通过在光路中引入一根0.3米长的单模保偏光纤,实现了基于光谱聚焦技术的超光谱SRS显微成像,使小范围内的化学分析成为可能。不仅如此,光纤的引入还保证了泵浦光和斯托克斯光具有绝对的共线性,稳定性以及较好的高斯光模式输出,为高分辨成像提供了保证。最后,基于空间分辨率和成像灵敏度的提高,本文展示了超精细的单细胞三维成像以及大范围未经染色处理的鼠脑组织切片的高分辨成像结果。除此之外,我们还利用高分辨超光谱SRS显微镜观察到了鞘磷脂在脑组织中的分布情况。本文的研究进一步推进了SRS成像技术的发展,为分辨率～130纳米的无标记高分辨生物医学成像提供了新的平台。
【学位单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318;TP391.41
【部分图文】：

分子作用,电磁场,电磁

在这种相互作用中，绝大部分入射光子与样本分子发生弹性碰撞，入射频率不逡逑会发生变化。此时，激发极化也不会改变分子原始的振动状态，因此大多数散射光逡逑子具有与入射光子相同的能量（Ｒａｙｌｅｉｇｈ散射，图１－１）。然而，当入射辖射诱导极逡逑化与分子的化学键振动变化耦合时，光子会发生非弹性散射（拉曼散射，图１－１）。逡逑对于一个可以产生拉曼散射的化学分子来讲，其化学键的极化率会有相应的变化，逡逑这样，在振动核附近的电子密度就会产生相应畸变。因此，多重键或富电子基团（如逡逑ＣＣ，ＯＮ和００）的振动产生的拉曼带比单键或缺电子基团的振动更强烈。逡逑自发拉曼散射效应中，光子会将样本分子从基态激发到虚态，如图１－２，处于逡逑虚态的分子自发降落到电子基态时，其振动能级或转动能级可能发生变化，伴随这逡逑个过程放出的光子将具有和激发光子不同的频率。如果分子最终状态的能量大于初逡逑始状态的能量，则放出的光子能量小于激发光子的能量，新光子称为斯托克斯光，逡逑频率的改变称为斯托克斯位移。相反

能级图,能级图,拉曼谱,拉曼成像

诱导样本中所有的化学键共振来获得拉曼谱，由于细胞中不同成分的化学键组成不逡逑同，它们的拉曼谱也各不相同，通过记录每个像素点的拉曼光谱，利用目标分子的逡逑特征峰即可完成对特定化学成分的特异性成像。如图１－３为牛血清白蛋白（ＢＳＡ）逡逑以及三油酸甘油酷（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ邋ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）的自发拉曼谱。值得注意的是，１８００－２８００逡逑ｃｎｒ１为生物体拉曼振动谱的静默区，细胞在此区域内没有拉曼峰。逡逑２－°１逦１邋＂ｓ逡逑＾逦逦Ｇｉｙｃｃｉｙｌ邋ｄｉｏｌｃａｔｃ逦＂邋５逡逑＝：逦逦ＢＳＡ逦ｒ逡逑ｉｒ邋ｉ邋ｉ逦＼［邋ｓ逡逑Ｉ。５：逦Ａ逡逑气。逡逑１２００逦１Ｍ）０逦１８００逦２７００逦３０００逡逑Ｒａｍａｎ邋ｓｈｉｆｔ邋（ｃｍ＇１）逡逑图１－３邋ＢＳＡ与ＴＯ的自发拉曼谱逡逑虽然自发拉曼光谱已经被广泛地使用，但是拉曼散射是一种非常微弱的效应，逡逑其散射截面为？ｌＯ－Ｍｃｍｈｒ—１，比荧光低约十个数量级［６］，成像时需要非常长的积分逡逑时间，这样，缓慢的采集速度、较差的分辨率和灵敏度的缺乏阻碍了自发拉曼成像逡逑方法进一步的发展，不能应用于快速的生物过程研宄，限制了拉曼成像方法在生物逡逑４逡逑

能级图,拉曼谱

｜＾ａｍａｎ邋美：，，vq逡逑＾＾＾＾＾Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ邋ｂｏｎｄｓ逡逑图１－２自发拉曼散射能级图逡逑自１９９０年Ｐｕｐｐｅｌｓ及其同事在活细胞及染色体的拉曼光谱检测方面上的开创性逡逑工作以来，自发拉曼光谱己被越来越多地用作分析细胞及其组分的重要平台Ｗ。由逡逑于拉曼散射是一种非侵入性技术，使用相对低的激发光能量，对样本产生非常小的逡逑扰动，所以，拉曼光谱适用于活体分析。通过固定波长的激光激发样本，可以同时逡逑诱导样本中所有的化学键共振来获得拉曼谱，由于细胞中不同成分的化学键组成不逡逑同，它们的拉曼谱也各不相同，通过记录每个像素点的拉曼光谱，利用目标分子的逡逑特征峰即可完成对特定化学成分的特异性成像。如图１－３为牛血清白蛋白（ＢＳＡ）逡逑以及三油酸甘油酷（Ｇｌｙｃｅｒｙｌ邋ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）的自发拉曼谱。值得注意的是，１８００－２８００逡逑ｃｎｒ１为生物体拉曼振动谱的静默区，细胞在此区域内没有拉曼峰。逡逑２－°１逦１邋＂ｓ逡逑＾逦逦Ｇｉｙｃｃｉｙｌ邋ｄｉｏｌｃａｔｃ逦＂邋５逡逑＝：逦逦ＢＳＡ逦ｒ逡逑ｉｒ邋ｉ邋ｉ逦＼［邋ｓ逡逑Ｉ。５：逦Ａ逡逑气。逡逑１２００逦１Ｍ）０逦１８００逦２７００逦３０００逡逑Ｒａｍａｎ邋ｓｈｉｆｔ邋（ｃｍ＇１）逡逑图１－３邋ＢＳＡ与ＴＯ的自发拉曼谱逡逑虽然自发拉曼光谱已经被广泛地使用

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