静电纺丝硬脊膜纳米纤维支架的构建与应用研究

发布时间：2020-09-05 10:54

　　研究背景脊柱外科手术导致硬脊膜损伤在临床上的发生率较高。如处理不当,可能会导致一系列不良的后遗症,如脑脊液漏,脑脓肿,脑膜炎,颅内出血,血肿和神经功能障碍等等。硬脊膜具有不可再生性,机体通常用疤痕愈合来填补硬脊膜缺损,而且目前临床上,也暂无结构与功能与天然硬脊膜类似的硬脊膜替代材料,这也导致了临床上硬脊膜缺损的治疗周期长、并发症多以及治愈率低下等问题。为实现硬脊膜高质量、疤痕少的自然愈合,迫切需要一种与天然硬脊膜结构相近且能引导硬脊膜胶原纤维按照硬脊膜胶原纤维排列方式生长的硬脊膜修复材料。本研究以山羊为研究对象,采用具有获取方便、生物相容性好和降解可控性等优点的生物工程材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为硬脊膜替代材料的原料,运用静电纺丝技术制备与天然硬脊膜空间结构类似的纳米纤维支架。观察测试支架的结构和力学性能是否与天然山羊硬脊膜接近,经过支架表面细胞种植验证其生物相容性后,回植山羊体内,探索纳米纤维支架修补硬脊膜缺损的可行性。目的构建与山羊硬脊膜空间结构类似的PLGA纳米纤维支架,探索支架在山羊体内回植修复硬脊膜缺损的效果。方法(1)观察山羊硬脊膜空间结构和表面形貌,测定硬脊膜力学特性,对山羊硬脊膜进行肉眼观察、扫描电镜观察、透射电镜观察、组织学光镜观察和拉伸力学测试。(2)使用静电纺丝技术制备出与天然硬脊膜空间结构近似的取向纳米纤维支架,对支架进行扫描电镜观察、拉伸力学测试和吸水率测定。同时也进行细胞种植实验以观察细胞在支架上的生长情况。用无规纳米纤维支架作为对照,进行对比研究。(3)纳米纤维支架修复山羊硬脊膜缺损实验及效果评估,将10只山羊随机分为两组,全部造成硬脊膜缺损为0.5cm×0.5cm的模型,将上述两种纳米纤维支架分别置入两组山羊体内。术后一个月取材,通过对修复区肉眼观察、组织学光镜观察和扫描电镜观察,评估修复效果。结果羊硬脊膜是乳白色的半透明薄膜,有一定的弹性,离开液体环境会自然回缩。硬脊膜是由胶原纤维和散在其中的成纤维细胞构成,硬脊膜具有各向异性的力学和结构特点。但是轴向和横向的差别并不是很大,其特点是靠近头侧各向异性差别小,而靠近尾侧的各向异性特点更为明显,但是靠近尾侧的厚度越小。胶原纤维直径在10nm-90nm之间。硬脊膜内外表面的胶原纤维取向性较为明显,主要为轴向取向,且被成纤维细胞覆盖,成纤维细胞沿着胶原纤维的方向排列。硬脊膜脑脊液侧表面成纤维细胞比较稀疏,可见裸露的胶原纤维,轴向纤维之间偶有联系,如同树枝,枝节交错。硬脊膜背脑脊液侧则被致密的成纤维细胞覆盖,纤维细胞沿着纤维取向排列,细胞之间紧密结合形成的凸起和凹陷,犹如沟壑相连、连绵不断的山丘。(2)取向纳米纤维支架纤维因为有明显的取向性,纤维取向方向上的力学强度明显大于垂直于纤维取向的力学强度。无规纳米纤维支架的纤维排列没有取向性。两种支架的力学强度都大于天然山羊硬脊膜的力学强度,能够满足山羊生理活动的力学要求。两种支架的亲水性接近,生物相容性接近。细胞在两种支架上的增殖速度接近,但取向纳米纤维支架上的细胞沿着纤维排列方向伸展生长,而无规纳米纤维支架上的细胞则呈圆盘状聚集生长。(3)取向术后1月取材,取向纳米纤维支架和无规纳米纤维支架能够诱导硬脊膜胶原纤维生长,促进硬脊膜生长,达到修复硬脊膜缺损的目的,其中取向纳米纤维支架修复结果因更接近天然山羊硬脊膜结构,可能是更适合的硬脊膜破损修复材料。结论以PLGA为原料,应用静电纺丝技术制备的取向纳米纤维支架和无规纳米纤维支架能够诱导硬脊膜胶原纤维生长,引导硬脊膜自然愈合,达到了封堵脑脊液和硬脊膜缺损的修补的目的,其中取向纳米纤维支架因更接近天然山羊硬脊膜结构,可能是更适合的硬脊膜破损修复材料。
【学位单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

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静电纺丝硬脊膜纳米纤维支架的构建与应用研究1.3 结果1.3.1 组织学光镜观察结果利用光学显微镜观察 HE 染色后的标本，镜下可见山羊硬脊膜由丝状的胶原纤维组成，粗细不匀，纤维呈波浪状，胶原纤维之间散在分布着梭形的成纤维细胞，硬脊膜背脑脊液侧面覆盖的成纤维细胞比脑脊液侧面多，如图 1。

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静电纺丝硬脊膜纳米纤维支架的构建与应用研究1.3.2 山羊硬脊膜扫描电镜观察结果SEM 观察结果：硬脊膜内外表面的胶原纤维取向性较为明显，主要为轴向取向，且被成纤维细胞覆盖，成纤维细胞沿着胶原纤维的方向排列。硬脊膜脑脊液侧表面成纤维细胞比较稀疏，可见裸露的胶原纤维，轴向纤维之间偶有联系，如同树枝，枝节交错。硬脊膜背脑脊液侧则被致密的成纤维细胞覆盖，纤维细胞沿着纤维取向排列，细胞之间紧密结合形成的凸起和凹陷，犹如连绵不断的山丘。见图 2。

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静电纺丝硬脊膜纳米纤维支架的构建与应用研究1.3.3 山羊硬脊膜透射电镜观察TEM 观察结果：通过观察硬脊膜横切面（垂直于轴向）、纵切面、斜切面可见，胶原纤维为圆柱体或椭圆柱体，山羊硬脊膜是由胶原纤维轴向、横向及少量其他方向纤维层叠而成，胶原纤维层与层之间有少量纤维联系。如图 3，通过KS400 图像分析软件（3.0 版，蔡司，德国）测量胶原纤维横截面直径介于10nm-90nm 之间，平均 68.42±18.59nm。

【参考文献】