3D打印组织工程复合支架修复恒河猴牙槽骨缺损的实验研究

发布时间：2020-09-11 23:47

　　临床上常见牙周病、外伤、肿瘤、先天性唇腭裂形成的牙槽嵴裂等各种原因造成的不同程度、不同范围的牙槽骨缺损,采取什么样的治疗方式,才能达到形态、功能和美观的完美修复,这是口腔界的一大难题。目前主要采用骨移植手术对骨缺损部位进行修复。从修复效果看,使用自体骨进行移植修复无疑是首选方案,但自体骨移植手术会因取材,给患者带来二次创伤。为减轻患者的创伤痛苦,临床上采用同种异体骨、异种骨、以及金属合金、高分子聚合物等人工骨作为代替材料进行移植修复,达到了一定的修复目的,但同时也需要面对相应的免疫排斥、组织相容、疾病交叉传播、以及材料生物学或力学性能等方面潜在的问题。骨组织工程为牙槽骨缺损的修复提供了新的方向。骨组织工程是将医学原理与工程技术结合,在各种因子的诱导下,使接种于支架材料上的细胞不断增殖,逐渐达到修复骨缺损的目的,其关键要素为细胞、支架、诱导因子。相关研究表明,骨髓间充质细胞可在适宜的条件下分化成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞等,是组织工程理想的种子细胞,但如何调控定向分化仍属难题。生物玻璃在促进组织修复方面具有突出的理化性能,采用纤维沉积设备打印溶胶-凝胶型微纳米生物活性玻璃三维多孔支架,可以在保证力学性能的前提下,通过微玻璃球堆叠自然形成微纳米级孔隙,有利于促进细胞的黏附、迁移和分化,赋予生物活性玻璃支架更优异的性能;同时纤维沉积技术避免了常规的热熔,有利于保留材料的生物活性或可能添加的生物因子;3D打印可以制备具有特定几何形状、尺寸和内部级孔结构多样化的三维支架,以满足临床上的不同需求。壳聚糖(ChitosanCS)是一种具有生物特性的优质载体,神经表皮生长因子样蛋白-1(Nel-liketypeⅠmolecular-1,NELL1)是一个新型有效的成骨因子,其相关研究正在探索完善中。本实验构建负载NELL-1的DNA(pDNA-NELLl)的CS纳米粒,将此纳米粒与3D打印的溶胶-凝胶型微纳米生物活性玻璃(3D printed and sol-gel micro-nano bioactive glasses,BG)进行复合,以恒河猴骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作为种子细胞、pDNA-NELL1 作为诱导因子、BG为支架,复合构成组织工程骨材料,植入到已制备的恒河猴牙槽骨缺损区模型中,以评价该组织工程植骨材料的原位成骨能力,观察BMSCs介导下基因修饰型微纳米生物玻璃复合材料对恒河猴牙槽大面积骨缺损的再生修复效果,以及检测再生部位牙槽骨的骨修复情况,以期为临床上修复不同几何形状、不同尺寸大小的牙槽骨、乃至其他部位的骨缺损,提供一种更有效、可行的组织工程骨材料,使组织工程骨修复向个性化的发展迈出一大步。本实验分为以下两个部分:第一部分BMSCs介导3D打印微纳米生物活性玻璃三维多孔支架复合NELL1-DNA组织工程骨材料的制备目的:构建和制备新型组织工程牙槽骨材料——BMSCs介导3D打印微纳米生物活性玻璃三维多孔支架复合NELL1-DNA的组织工程骨(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),并完成实验分组。方法:1.本实验中所用的3D打印微纳米生物活性玻璃支架是由华南理工大学国家人体组织功能重建工程技术研究中心提供,针对本实验的特殊性和要求,综合采用溶胶-凝胶技术与有机模板自组装技术制备介孔生物玻璃微球,以直径为350 nm左右的生物活性玻璃微球为打印材料、聚乙烯醇为粘结剂,采用纤维沉积设备打印生物活性玻璃三维多孔支架,成功制备出10mm×10mm×5mm长方体生物玻璃支架,孔径长宽为250 μm,并在支架表面涂覆高浓度PBS缓冲液和海藻酸钠磷酸盐复合液形成K3CaH(P04)2沉积表面,以最大程度的增强生物活性玻璃支架材料的抗压强度,并具有良好的体外磷灰石形成活性。该生物活性玻璃支架能够提供骨组织修复过程中促进骨细胞增殖需要的微孔尺寸在150-500 μ m范围内、孔隙率不小于40%的连通多孔的三维环境,且具有良好的生物活性和可降解性,其相关性能该研究中心已做过完善的实验及研究并已发表成果。2.培养恒河猴骨髓间充质干细胞(BMSCs):穿刺抽取恒河猴骨髓,将其放在含有10%的胎牛血清和1%的双抗的DMEM/F12的培养基进行培养,使骨髓组织贴壁生长,收集传代培养第3、4代细胞。显微镜下观察BMSCs的生长方式及形态学变化、染色实验检测BMSCs成骨分化能力,CCK-8实验评价细胞增殖能力。3.制备壳聚糖包载pDNA-NELL1纳米粒:将10g壳聚糖溶于360mL的NMP(1-甲基-2-吡略烷酮),搅拌下加入35mL15%NaOH、57.5mLCH3I。经过沉淀获取TMC。取0.4 mL pDNA-NELL1溶于骨涎蛋白溶液(BSP)中,配成浓度为0.5mg/mL的DNA溶液,将0.4mL此溶液加入离心管中,然后加入1.2mL浓度1mg/mL TMC的BSP溶液,混合震荡后制备出N/P值为10的载pDNA-NELL1的纳米颗粒溶液(CSn)。4.BMSCs介导3D打印溶胶-凝胶型生物活性玻璃三维支架复合NELL1组织工程骨材料的制备,实验分组。所有支架均经过预处理,准备浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液、浓度为5×106 cells/mL的BMSCs细胞悬浮液,开始分组制备组织工程骨。实验分4组,对照组3组和实验组。Ⅰ.对照组1(BG):220 μL生理盐水滴加到BG支架上,浸润4-6个小时,接着滴加200 μL生理盐水(与下面各组滴加的细胞悬浮液等量)。Ⅱ.对照组2(BG+BMSCs):220 μL生理盐水滴加到BG支架上,浸润4-6个小时,接着滴加200 μL BMSCs细胞悬浮液。Ⅲ.对照组3(BG\CSn+BMSCs):先混合200 μL壳聚糖溶液和20 μL生理盐水,涡旋震荡30秒,将混合液220 μL滴加到BG支架上,浸润4-6个小时,接着滴加200 μL BMSCs细胞悬浮液。Ⅳ.实验组(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs):先混合200 μL壳聚糖溶液和20 μ L壳聚糖包载的pDNA-NELL1纳米粒混合液,涡旋震荡30秒,将此混合液220 μL滴加到BG支架上,浸润4-6个小时,接着滴加200 μL BMSCs细胞悬浮液。上述操作步骤保障对照组2、3和实验组的支架材料中均种有1 × 106个细胞。结果:1.电镜下支架成微球状排列,BG微球表明粗糙,BMSCs细胞粘附于支架。2.显微镜下观察恒河猴BMSCs体外培养期细胞形态变化,细胞传代至第三代时细胞呈纺锤样,形成辐射或旋涡样的紧密排列。碱性磷酸酶、茜素红染色实验均呈阳性,证明BMSCs在体外诱导成功向成骨细胞分化。3.成功制备大小为10mm×10mm×5mm组织工程牙槽骨材料,并分为4组,BG、BG+BMSCs、BG\CSn + BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs。结论:以恒河猴BMSCs作为种子细胞、NELL1作为细胞因子、3D打印的溶胶-凝胶型生物活性BG为支架,可制备出新型的BMSCs介导3D打印生物活性玻璃三维支架复合NELL1基因的组织工程牙槽骨骨材料。第二部分组织工程骨修复恒河猴牙槽骨缺损的动物实验实验一:动物实验—恒河猴牙槽骨缺损模型的组织工程修复目的:恒河猴牙槽骨缺损模型的组织工程修复,用于检测组织工程材料修复牙槽骨缺失模型的可行性,以及为后续观察和评价组织工程牙槽骨的修复能力建造平台。方法:1.建立牙槽骨缺损模型:4只成年雌性恒河猴,随机编号A、B、C、D号,上下左右颌骨按照口腔国际区域编码为1、2、3、4四个象限,共计16个牙槽骨实验区。术前24小时禁食禁水,全身麻醉,消毒,分别拔除ABCD猴的四个象限的第一、二前磨牙,磨除拔牙窝周边骨及颊侧骨皮质,保留舌侧的骨皮质,建立约10mm×10mm×5mm大小的、共计16个的牙槽骨缺损区。2.组织工程牙槽骨材料植入手术:在ABCD猴的4个牙槽骨缺损区分别随机植入4种骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs),但保证每只恒河猴的每个牙槽骨缺损区植入的骨材料是不同的,以消除不同猴之间、不同牙槽骨缺损区之间的差异。植入组织工程骨后,缺损缝合,严密覆盖植入的组织工程牙槽骨。3.术后行X光检查,检查植骨材料的植入情况。4.术后护理:牙龈缝合后局部消毒,术后2周给予软食。术后连续7天全身用药抗感染。术后每天两次用2%洗必泰50 mL口腔冲洗和手术部位消毒,持续2周。5.术后观察:ABCD猴的日常活动、饮食、情绪有无异常,伤口有无红肿、渗出等炎症反应,以及有无化脓、坏死等并发症的发生。若无异常,2周后拆线。结果:1.在A、B、C、D猴的四个象限分别建立牙槽骨缺损模型,并将4种骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分别成功植入牙槽骨缺损区,每只猴的每个象限所植入的材料均不同。2.X光片示:ABCD猴的4个牙槽骨缺损区均有骨材料植入。3.术后2周加强护理,2周内观察到ABCD猴的日常活动、饮食、情绪无异常,伤口无红肿、渗出等炎症反应,无化脓、坏死等并发症的发生。2周后拆线。结论:成功在ABCD猴的四个象限建立牙槽骨缺损模型,并将4种骨材料(BG、BG+BMSCs、BG\CSn+BMSCs、BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)分别植入牙槽骨缺损区,术后两周无炎症反应和并发症发生。实验二:组织工程骨修复牙槽骨缺损动物实验模型的评价目的:组织工程牙槽骨材料植入恒河猴牙槽骨缺损区术后12周,二次手术,观察、检测新型组织工程骨材料对恒河猴牙槽骨缺损的修复效果,评价其成骨性能。方法:1.植入材料术后12周,植骨区拍摄X光片。2.二次手术,术中观察植骨区,并取ABCD猴的四个象限的植骨区骨:术前24小时禁食禁水,全身麻醉,消毒,分别拔除ABCD猴的四个象限的尖牙,翻瓣后观察植骨区,然后取骨,取骨的范围大于第一次手术的植骨区,分离出15mm×12mm×7mm大小骨块,标号。3.Micro-CT三维重建以观测骨组织内部的修复情况。4.组织学检查:将标本置于10%甲醛水溶液中固定7天。共计16个骨标本。固定后包埋切片,HE染色。结果:1.X线结果:实验组(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)显示植骨材料与周边骨界线不清,植骨材料几乎被完全吸收改建,骨小梁结构清晰,数目较多,呈网状结构均匀排列,骨皮质比较均匀连续,牙槽嵴高度比对照组都高,牙槽嵴顶高度几乎与周边自体骨相一致,植骨区呈大范围的高密度阻射阴影区。对照组1(BG)显示植骨材料与周边骨界线较清楚。越接近周边骨的材料吸收改建,可见稀松的骨小梁结构散在排列。近牙槽嵴顶可清晰看到植骨材料。对照组2(BG+BMSCs)显示植骨材料与周边骨界线不清,植骨材料几乎被完全吸收改建,骨小梁结构清晰,但数目较少,散在排列。牙槽嵴顶呈U型,最凹处低于周围自体骨高度。对照组3(BG\CSn+BMSCs)显示植骨材料与周边骨界线不清,植骨材料几乎被完全吸收改建,骨小梁结果清晰,数目较少但比BG+BMSCs组多,散在排列。牙槽嵴顶呈U型,最凹处低于周围自体骨高度,植骨区阻射阴影密度高于BG+BMSCs组。2.术中翻瓣后,肉眼可观察到有新骨形成,新骨的大小和植入材料相类似,可观察到新生骨与周围正常骨组织分界不明显,新骨表面较光滑平整没有明显的凹陷或者凸起,表面并有骨膜覆盖。3.Micro-CT三维重建图像显示,实验组和对照组都有新骨生成,实验组比对照组骨小梁更加粗大,骨小梁排列更紧密,骨密度更高。BG组见骨小梁形成凌乱稀疏无规则,可观察到有空洞形成。BG+BMSCs组和BG\CSn+BMSCs组植骨区骨小梁结构清晰,数量较多,均未发现空洞,新骨与周边骨形成整合,观察不到明显界线,骨缺损愈合良好。4.组织切片HE显示,实验组(BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs)显示新生骨组织与周边骨完全融合,形成致密的新骨,有大量成熟的骨细胞。BG组新骨形成有大量的空腔和结缔组织,骨细胞形成数量少,位置比较稀疏。BG+BMSCs组和BG\CSn+BMSCs组新骨密度、数量低于实验组,但都高于BG组,空腔和结缔组织的数量小于BG组。结论:构建的组织工程骨材料BG\CSn(pDNA-NELL1)+BMSCs植入恒河猴牙槽骨缺损区实验中,肉眼、X-ray及Micro-CT观察显示新生骨量、密度、硬度、结构与正常骨极为接近,骨皮质光滑与周边正常骨连接紧密。组织学观察显示缺损区炎反应小,新生组织结果接近正常骨,有效促进恒河猴牙槽骨缺损的修复。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08;R782.1
【部分图文】：

形态,细胞

图３：邋ＢＭＳＣｓ接种第８天的形态（细胞呈长梭形）逡逑

细胞融合,细胞体积,多角形,形态

图２：邋ＢＭＳＣｓ接种第４天的形态（细胞呈多角形）逡逑培养至第７－９天细胞融合至８５％左右时，细胞体积有所增大，细胞形态较均逡逑

形态,细胞,器皿,体外培养

Ａ逦ｘ邋１００逦Ｂ逦Ｘ２００逡逑图１：邋ＢＭＳＣｓ提取第１天的形态（细胞呈圆形）逡逑胞ＢＭＳＣｓ体外培养在显微镜下的形态动态观察逡逑，除去未贴壁生长的杂质细胞。三天后可见在器皿壁出一－

【参考文献】