丝素修饰左旋聚乳酸多孔微球构建可注射组织工程软骨的研究

发布时间：2020-09-17 18:35

　　 背景:软骨缺损的治疗和软骨相关美容是整形外科的重要内容,传统自体移植的方法存在诸多问题,例如来源有限、供区受损、不同程度软骨吸收等等。组织工程技术的出现为此开辟了新的手段。软骨组织工程技术处于研究阶段,尚未在临床广泛开展,还有许多技术难题需要解决,例如如何在体外获得大量表型良好的种子细胞,如何找到制作简单、生物相容性好的支架等。微载体技术用于大规模扩增贴壁细胞已经有数十年历史,三维的培养环境和体内环境更加接近,更有利于细胞生长和发挥功能,此外,随着微载体材料的不断进展,微载体除了培养细胞,还可以作为组织工程的支架。常用的合成聚合物左旋聚乳酸(Poly-L-lacticacid,PLLA)材料制造的多孔微球载体对细胞亲和性不够,有研究证实丝素蛋白(silk fibroin,SF)可促进软骨细胞的生长,我们使用丝素修饰的方法对左旋聚乳酸多孔微球载体进行改进,为软骨细胞培养和软骨组织工程提供一种新的多孔微球载体和支架。目的:1、明确微载体三维动态培养对耳廓软骨细胞增殖和表型的影响,为建立规模化扩增提供技术参考。2、对比左旋聚乳酸(PLLA)多孔微球载体、丝素蛋白(SF)修饰PLLA多孔微球载体、市售商业微球载体Cultispher G三种微载体体外培养对耳廓软骨细胞生物学行为的影响,为软骨细胞三维动态培养寻找合适的载体。3、利用多孔微球载体在兔鼻背处构建可注射性组织工程软骨,并探讨使用这种方法隆鼻的效果。方法:1、应用胰酶、胶原酶消化法分离猪耳软骨细胞,并将获得的软骨细胞分为3组培养:培养皿单层培养、微载体三维静止培养和微载体三维动态培养。应用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、荧光倒置显微镜、冰冻切片DAPI染色观察细胞在微球上的生长情况,DNA定量检测软骨细胞增殖情况,Real-time PCR检测软骨相关基因表达。2、应用胰酶、胶原酶消化法分离兔耳软骨细胞,将获得的P1代软骨细胞分别接种于PLLA、SF修饰PLLA和Cultispher G多孔微球上,并于旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)中进行培养。应用电镜和冰冻切片DAPI染色观察细胞在微球上的生长情况,DNA定量检测软骨细胞增殖情况,Real-time PCR检测软骨相关基因表达,组织学检测软骨细胞胞外基质分泌情况。3、将兔耳软骨细胞接种于SF修饰的PLLA多孔微球支架上,体外培养1周,和透明质酸混合后注入兔鼻背处,大体观察隆鼻效果,组织学检测观察组织工程软骨形成情况。以透明质酸混合软骨细胞和单纯透明质酸作为对照。结果:1、培养皿单层培养时,软骨细胞在4 d时进入平台期,微载体动态培养组软骨细胞对数生长期延长为2-10 d,细胞数量在14 d达到高峰,微球静止培养组细胞增殖速度缓慢;在长期体外培养中,二维单层培养和微载体静止培养软骨表型丧失,而微载体三维动态培养在促进细胞增殖的同时,能够维持软骨表型。2、PLLA、SF-PLLA 和 Cultispher G 三种微球接种率分别为 37.67%±2.33%、53.67%±3.69%、73.67%±3.53%。细胞增殖方面,PLLA多孔微球和SF修饰的PLLA多孔微球细胞增长倍数高于Cultispher G多孔微球。Real-time PCR显示SF修饰PLLA多孔微球对软骨表型的维持优于其他两组。组织学检测发现,糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌量均为SF修饰PLLA多孔微球组最高。3、多孔微球+透明质酸+软骨细胞组和透明质酸+软骨细胞组均可形成软骨样组织,组织学染色观察两组镜下观无明显差别,但是加入微球能提高软骨块的硬度和弹性。多孔微球+透明质酸+细胞组隆鼻效果维持时间最长,透明质酸+软骨细胞组其次,单独透明质酸最短。结论:1、微载体联合旋转细胞培养系统三维动态培养能够在大量扩增软骨细胞的同时维持良好的软骨表型,可以作为耳廓软骨细胞规模化扩增的一种方法。2、与PLLA多孔微球和Cultispher G多孔微球相比,SF修饰PLLA多孔微球更适合软骨细胞的体外三维培养。3、将微球加入透明质酸可以改善其作为水凝胶支架机械强度不足的缺点,两者联合使用构建可注射组织工程软骨为注射隆鼻提供了一个新的选择。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

微载体三维培养时，软骨细胞可快速贴附于微载体表面，微载体静止培养２１逡逑天时软骨细胞外基质分泌增加，将微球包裹，聚集成团；微球动态培养组的细胞外逡逑基质分泌量更多，微球之间结合更为牢固（图１．２）；电镜下更为明显，微载体静止逡逑组中微载体上的细胞量少，微球之间依靠细胞外基质部分相连，动态组细胞外基质逡逑将微球完全包裹，数个微球聚集成紧密的小团块。细胞膜绿色荧光染色（ＤｉＯ）和逡逑冰冻切片ＤＡＰＩ染色显示：微球中有细胞生长，表面黏附的细胞更多。微球动态组逡逑细胞数量多于微球静止组，而且动态培养组细胞分布更为均匀（图１．２）。逡逑ｐｉＫ烰￥

本文编号：2821076