Dex-g-PLL-VAPG的制备及负载microRNA-145的PLGA电纺膜调控血管平滑肌细胞的研究

发布时间：2020-09-18 19:01

　　在血管组织中,microRNA-145(miRNA-145)可通过抑制转录因子KLF4的表达,提高其下游基因促血管平滑肌细胞分化因子(myocardin)的表达活性,调节血管平滑肌细胞(SMCs)的表型,抑制其增殖。因此,在小口径人工血管材料中引入miRNA-145,有望抑制内膜增生,实现小口径血管的长期通畅性。然而,裸露的miRNA容易被核酸酶降解,而且非特异性摄入易造成生物毒性。因此,设计一种可靶向、低毒,并可以长期局部释放miRNA-145的递送体系成为关键。葡聚糖是天然中性多糖,高度亲水,生物相容性和生物降解性优异。本文通过活化葡聚糖环上的羟基,引发接枝聚赖氨酸,并引入可特异性结合SMCs的小肽缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(VAPG),用作miRNA-145载体,以提高miRNA的靶向性和转染效率。接着,通过乳液电纺将miRNA-145负载到聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)电纺纤维中,用于调节SMCs的表型和增殖行为。结果表明,所制备的葡聚糖-g-聚(L-赖氨酸)-VAPG(Dex-g-PLL-VAPG)对miRNA-145具有良好的复合能力和保护能力,对SMCs具有较低的生物毒性。并且,VAPG的修饰可促进miRNA特异性进入SMCs,摄入效果和转染效率优于商用转染试剂Lipo2000。另外,负载miRNA-145的PLGA电纺纤维膜生物相容性良好,SMCs可以很好地粘附和增殖。两个月的释放结果表明,miRNA突释率约为15%,总释放量大于80%。体外细胞培养结果显示,纤维膜中释放出来的miRNA-145,在Dex-g-PLL-VAPG作用下,更为有效地抑制了KLF4的表达,提高了myocardin和SMCs分化标志基因α-SMA的表达活性。以聚(乙二醇)-b-聚(丙交酯-co-己内酯)电纺膜为内层,以负载Dex-g-PLL-VAPG/miRNA-145的PLGA电纺膜为外层,构建双层小口径人工血管材料,并植入兔颈动脉进行为期两个月的体内实验。通过组织染色和免疫荧光染色发现,负载Dex-g-PLL-VAPG/miRNA-145复合物的电纺材料更为效地促进了SMCs向收缩表型增长,同时逐渐建立了内皮层和细胞外基质微环境。综上,本文成功制备了一种具有较好的稳定性、低毒、可靶向和可持续释放miRNA的递送体系,可以有效地调节SMCs的生长行为,在血管组织工程领域具有潜在的应用价值。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

趋势图,纤维膜,细胞生长,趋势图

天津大学硕士学位论文来说，将其电纺到纤维的芯部可以防止其迅速扩散，从而降低21]最早利用乳液电纺的方式，以聚氧化乙烯(PEO)和盐酸阿霉聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)为油相，制备了具有芯壳LA 电纺纤维。研究表明，这种芯壳结构保护了 Dox 的生物步释放过程中对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。纺制备芯/壳结构的关键在于乳液的稳定性，因此需要在制备一些赋形剂如 F127、BSA 或右旋糖酐等使得乳液可以均匀地物质加以保护。Yang 等[22]先将 QK 包载到 CS 凝胶中作为水入适量的 BSA 保护 QK 的活性，再通过乳液电纺的方式将胶负载到 PELCL 电纺纤维膜中，减缓了 QK 的突释，有效性，可以长期对内皮细胞生长起促进作用。纺丝在控制释放方面的应用

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天津大学硕士学位论文开环聚合，与 PLLA 相比，克服了 PLLA 的脆性，得到了亲水性和力学性有改善的聚乙二醇-b-聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)共聚物(PELCL)，而且我们可过改变 CL 和 L-LA 单体的控制 PELCL 的降解速率，更加适合于细胞的粘附殖[14-15]。此外，虽然静电纺丝技术可以制备出多孔结构的血管支架，但是孔径过小于细胞的迁移，渗透以及组织的再生。因此，Wang 等[33]结合了静电纺丝和喷雾技术制备了含有 PCL 电纺纤维和聚氧化乙烯(PEO)微粒的支架，后期通去 PEO 获得了大孔径支架。之后 Wang 等[34]又通过改变电纺参数制备了纤径为 5~6 μm，孔径约为 30 μm 的大孔径，如图 1-2 所示，发现该大孔径支著提高了细胞的渗透性，加速了 ECM 的分泌，通过体内实验发现在 100 天成了完整的内皮层，通畅性较好，而且形成了具有类似于天然血管的 ECM，重要的是，新生血管在肾上腺素和乙酰胆碱的刺激下具有良好的收缩和舒张。

形貌,粗直径,直径

更为重要的是，新生血管在肾上腺素和乙酰胆碱的刺激下具有良好的收缩和舒张功能。图 1-2 PCL 电纺膜的 SEM 形貌图. (A)粗直径(B)细直径Figure 1-2 SEM images of electrospun PCL mats with thicker fibers (A) and thinner fibers(B)合成生物可降解材料在血管组织工程中具有良好的应用前景，可控性强，而且弥补了天然材料力学性能的缺陷，但仍然存在一定的问题，如缺乏生物信号，细胞生长和组织再生缓慢，容易造成局部的无菌炎症反应等。1.2.2.3 天然与合成复合材料天然材料具有良好的生物相容性，合成可降解材料具有良好的机械性能和可控性，将两者按照一定的比例组合得到的复合材料是近年来小口径血管研究的热点。复合材料综合了两者的优势，保证了支架良好的机械性能，又改善了支架的生物相容性。Atala 等[35]采用 45%胶原蛋白、15%弹性蛋白和 40%的 PLGA 制备8

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