LMP-1重组慢病毒载体感染人胎盘源间充质干细胞的诱导和定向分化

发布时间：2020-09-19 11:20

　　研究目的:胎盘源间充质干细胞(human placental-derived mesenchymal stem Cells,HPMSCs),是取于人足月胎盘组织中的一种新的成体间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),HPMSCs因取材便利,来源丰富,具成骨、成脂等多向分化潜能及免疫抑制等众多优势,近几年来备受学者关注。骨矿化蛋白-1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)作为细胞内非分泌蛋白,在人和动物的骨骼、肺脏、脾脏、白细胞及人牙周膜细胞、牙髓细胞、成牙本质细胞等中均有不同水平的表达,在骨基质的矿化过程及成骨细胞分化过程中起着重要作用。目前为止,关于LMP-1促HPMSCs成骨分化作用机制尚不清楚,本实验预构建长久稳定表达LMP-1蛋白的HPMSCs,并对LMP-1在促骨形成过程中释放的细胞因子相关的成骨信号通路进行初步探讨。研究方法:1.组织块培养法分离培养人胎盘源间充质干细胞,获得较纯的HPMSCs后对其进行成骨、成脂诱导,验证其多向分化能力。2.同一感染复数下分别用腺病毒和慢病毒载体系统感染HPMSCs,3天、7天后于荧光显微镜下观察GFP蛋白表达情况。构建重组LMP-1慢病毒表达体系,包装纯化后感染HPMSCs,筛选稳转株。通过qPCR和Western Blotting检测LMP-1基因及蛋白的表达情况。3.CCK-8法检测LMP-1对HPMSCs增殖的影响,成骨诱导一周后,通过ALP染色和活性检测,实时定量PCR与Western Blotting检测成骨相关基因TGF-β1,Smad2,Runx2的表达情况,比较空白对照组,阴性对照组,LMP-1高表达组三组细胞成骨分化能力的差异。结果:1.镜下观察HPMSCs传至第三代后呈成纤维细胞样形态;成骨诱导14天后行碱性磷酸酶染色见蓝染区域,21天后行茜素红染色镜下见矿化结节;成脂诱导21天后行油红O染色镜下见脂滴形成。2.感染3天时腺病毒感染率略高于慢病毒,到第7天时慢病毒仍有较高表达率,而腺病毒载体已近乎不表达。成功构建了重组LMP-1慢病毒表达载体,包装纯化后筛选出稳转株,LMP-1的mRNA和蛋白水平均高表达。3.CCK-8结果显示高表达LMP-1组细胞增殖能力减弱,高表达LMP-1组矿化能力,ALP活性,成骨细胞因子TGF-β1,Smad2,Runx2表达水平均上升。结论:1、成功分离培养了HPMSCs,并鉴定其具有多向分化潜能,符合干细胞特征。2、相同感染复数下,慢病毒载体相比于腺病毒载体感染HPMSCs的感染率高。成功构建了重组LMP-1慢病毒载体,并筛选出HPMSCs-LMP1稳转细胞株。3、LMP-1可能通过提高TGF-β1/Smad2信号通路中TGF-β1,Smad2,Runx2的表达量来促进HPMSCs成骨向分化。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：

杂细胞,间充质干细胞,染色效果,旋涡状

（6）吸走油红 O 染液，用 60%异丙醇脱色 3 秒，吸弃。（7）将六孔板每孔加入 2mL PBS，置于显微镜下观察染色效果。2.3 结果2.3.1 HPMSCs 的形态及生长状况组织块培养法培养得到原代细胞，约 7 天左右即可在镜下观察到少量贴壁细胞从组织块周围爬出呈长梭形，并可看到血细胞等杂细胞（图 2.1A）。经过数次换液后约 20 天左右即可看到组织块周围有较多梭形细胞呈放射状排列，生长迅速（图 2.1B）。传至三代时即可得到形态单一，贴壁紧密，纯度较高的胎盘源间充质干细胞，细胞呈旋涡状生长（图 2.1C）。

脂滴,油红,诱导分化,细胞内

图 2.2 HPMSCs 成骨分化Figure 2.2 Osteogenic differentiation of HPMSCs2.3.3 HPMSCs 的成脂诱导分化检测成脂诱导第 10 天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现（图 2.3A），随着时间延长可见脂滴增大融合，21 天后油红 O 染色“阳性”，脂滴染成红色（图 2.3B）。

LMP-1重组慢病毒载体感染人胎盘源间充质干细胞的诱导和定向分化

HPMSCs成脂分化

【参考文献】