天然渗透压调节剂在细胞冷冻保存中的应用研究

发布时间：2020-09-30 21:23

　　细胞作为生命的基本单元,在生命科学、医学等领域具有重要的研究意义,也已经广泛应用于细胞治疗、组织工程和药物开发等领域。目前,超低温冷冻保存(冻存)是细胞长期保存最可靠的手段,而冻存保护剂是成功实现超低温保存的关键。然而当前冻存保护剂的局限性,特别是细胞毒性,限制了冻存技术的发展。因此,开发高效无毒的新型冻存保护剂意义重大。我们发现天然渗透压调节剂是广泛存在于生物系统中的亲水性分子,通常具有良好的生物相容性。因此,本文基于冻存损伤机理,提出天然渗透压调节剂可能成为冻存保护剂的理想候选,并考察了它们的冻存保护效果。首先,本文对三种代表性天然渗透压调节剂(脯氨酸、甘氨酸、牛磺酸)的细胞毒性、细胞渗透压调节能力和水溶液的热力学性质进行了研究,系统评价了它们的生物相容性、防止渗透压损伤和冰晶损伤的能力,发现脯氨酸能力最为突出。然后,采用超速冻存法实现了四种细胞系(GLC-82、LTEP-a-2、3T3、SMCs)的高效冻存,发现脯氨酸冻存效率最高,且显著优于传统冻存保护剂DMSO。基于以上实验结果,本文进一步探讨了冻存保护机理。其次,本文又将天然渗透压调节剂用于红细胞的超低温冻存,并取得了良好的效果。其中脯氨酸的冻存效率最高,与调节红细胞渗透压的能力规律一致。溶血率、细胞形态等测试证明天然渗透压调节剂可以迅速洗脱实现快速供血,具有良好的血液相容性。从而为解决当前红细胞“金标准”冻存保护剂甘油在洗脱过程中极易导致红细胞溶血的难题提供了有力手段。最后,本文还开发了天然渗透压调节剂与天然/合成聚合物的组合配方,进一步提高冻存保护效果,并初步探索它们的协同保护机理,为新一代冻存保护剂的开发提供了方向。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：

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刺伤细胞膜和细胞器，破坏细胞结构的完整性，对细胞造成不可逆转的机械物理损伤，这种损伤称为冰晶损伤。在超低温冻存过程中，渗透压损伤和冰晶损伤往往是同时存在的。两种冻存损伤的示意图如图1-1所示。图1-1 超低温细胞冻存损伤示意图Figure 1-1 Schematic drawing of cryoinjuries in cell cryopreservation

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具有很大的关系，是有潜力作为冻存保护剂的天然渗透压调节剂的典型代表，也是本文的主要研究对象。脯氨酸、甘氨酸、牛磺酸和常用冻存保护剂DMSO的分子结构式如图1-2所示。图1-2 脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、牛磺酸（Tau）和DMSO的分子结构Figure 1-2 Molecular structures of Pro, Gly, Tau and DMSO三种天然渗透压调节剂在人体内含量丰富，脯氨酸和甘氨酸都是蛋白质合成的关键原料，牛磺酸是一种人体内大量存在的非蛋白β-氨基酸。它们不仅是调控细胞生化反应和生理过程所必需的功能性氨基酸，而且还是人体必需的营养物质。它们在人体血浆、组织、器官中天然存在。脯氨酸和甘氨酸各占人体胶原蛋白（人体内最丰富的蛋白）中氨基酸总量的30%。脯氨酸在血浆中的游离浓度为51-271μM，也是人体蛋白质合成中需求量最高的氨基酸，在初生婴儿体内脯氨酸占有全身蛋白质含量的8.3%（wt）[60, 61]。甘氨酸在血浆中的浓度为52-224 μM，对于70 kg的成年人来说，每天用于胶原蛋白合成的甘氨酸需求量为10 g，每天通过饮食摄取的甘氨酸可达1.5-3g[62, 63]。牛磺酸是人体细胞内含量最丰富的游离氨基酸

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床应用的瓶颈问题。因此，在新型冻存保护剂的开发中，生物相容性是必须要考虑的因素。图2-2 天然渗透压调节剂（脯氨酸，甘氨酸，牛磺酸）和DMSO对GLC-82细胞的细胞毒性。（A）活死染色荧光图。绿色，活细胞；红色，死细胞；比例尺=100 μm；（B）细胞存活率；（C）细胞贴壁形态。比例尺=100 μmFigure 2-2 Cytotoxicity of natural osmoprotectants (Pro, Gly, Tau) and DMSO to GLC-82 cells.(A) Fluorescence images of the live/dead assay. Green, live cells. Red, dead cells. Scale bar = 100μm. (B) Cell viability. (C) Attachment morphology. Scale bar = 100 μm脯氨酸、甘氨酸和牛磺酸都是在自然界中大量而广泛存在的天然渗透压调节剂[60, 88, 89]，在生物系统中通常具有良好的生物相容性。为了验证它们对细胞的生

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