磷酸功能化明胶和多巴功能化表皮生长因子用于生物材料表面改性的研究

发布时间：2020-10-13 11:22

【摘要】：金属钛在骨骼、关节等领域的再生修复中广泛应用,但是钛移植物在机体中的细胞相容性较弱,细胞难以粘附和伸展、不利于细胞增殖。钛表面改性是解决这一问题的重要方法。明胶是胶原蛋白碱性水解或酸性水解的产物,具有利用细胞粘附、伸展和增殖的作用。利用明胶对钛表面改性可以增强钛的细胞相容性,但是明胶溶液在室温下呈凝胶状,需要加热使其溶解,而且明胶在钛表面粘附不牢固,易脱落。为了解决这一问题,我们拟利用3-氨基丙烷-1-磷酸对明胶进行修饰,获得粘附性的磷酸功能化明胶(Phosphonated gelatin,P‐gelatin),使其更好的固定于钛表面,以提高钛表面的细胞相容性。游离的生长因子在液体的培养环境中易被稀释和代谢,因此使用量大、作用时间短、浓度不易调控。如何更好地发挥其对细胞生长、增殖或分化的调控作用,是组织工程的另一个研究热点。生长因子与粘附性片段相结合,固定于材料表面是解决这一问题的方法。本研究拟利用多巴(DOPA)设计一段粘附性多肽序列,接入到表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)的羧基端,得到多巴功能化表皮生长因子(EGF-DOPA)。以胶原蛋白膜为支架材料,研究EGF-DOPA在胶原蛋白膜上的吸附能力,及其对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的增殖影响。明胶与3-氨基丙烷-1-磷酸进行酰胺化反应得到P-gelatin,核磁共振磷谱检测磷酸基团是否结合到P-gelatin分子中。用圆二色光谱检测P-gelatin的构象变化。通过检测P-gelatin溶液在不同温度下的OD600,分析其凝胶化与温度的关系。将P-gelatin用于钛表面改性,利用飞行时间二次离子质谱分析P-gelatin与钛片的结合情况。用石英晶体微天平检测钛片表面的P-gelatin的表面浓度,用原子力显微镜观察P-gelatin修饰的钛片表面形貌和P-gelatin层的厚度。接触角检测仪检测P-gelatin修饰的钛片表面水和甘油的接触角,研究钛片表面亲水性的变化。圆二色光谱检测结果显示,明胶的二级结构没有因为磷酸功能化而发生显著性变化。凝胶化温度却发生了显著的变化,明胶在磷酸功能化之后,即使浓度为3%的溶液在室温下也不会发生凝胶化。将P-gelatin固定在钛表面后,飞行时间二次离子质谱分析结果表明,P-gelatin与钛存在化学键连接。钛表面P-gelatin的表面浓度随P-gelatin溶液的浓度增大而升高,当溶液浓度大于2%时,表面浓度趋于饱和。原子力显微镜结果显示,P-gelatin在钛片表面形成了厚度约为5nm的粗糙涂层。P-gelatin涂层降低了钛片表面的亲水性,有利于细胞的粘附和伸展。细胞培养实验结果显示,P-gelatin对钛片的修饰显著促进小鼠成骨细胞MC3T3的粘附、伸展及增殖。用固相合成的方法将含有DOPA的粘附性氨基酸序列,连接于EGF的羧基端,得到EGF-DOPA。通过圆二色光谱对比EGF-DOPA和EGF的二级结构。用ECL方法检测EGF-DOPA在胶原蛋白膜表面的固定能力。用CCK-8法分别检测游离的和固定在胶原蛋白膜表面的EGF-DOPA对细胞增殖的影响。圆二色光谱实验结果表明,EGF-DOPA没有明显的构象改变。然而由于多巴结构的强粘附性,EGF-DOPA在胶原蛋白膜表面的粘附量显著高于EGF。游离的EGF-DOPA对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的促进作用与EGF相似。固定在胶原蛋白膜表面后,EGF-DOPA对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3增殖的促进作用显著高于EGF。这是由于多巴功能基团的高黏附性,使生长因子更好的发挥促细胞增殖作用。综上所述,本课题成功地制备了P-gelatin和EGF-DOPA。这两种生物活性分子用于生物材料表面改性,可以提高生物材料的细胞相容性。利用这两种功能性蛋白分子对生物材料进行表面修饰,可以作为生物材料表面改性的新方法,为获得表面功能性生物医用材料的提供了新的思路。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要中英文名词、缩写对照表
第一章 绪论
    1.1 组织工程
        1.1.1 组织工程概述
        1.1.2 组织工程的三要素
        1.1.3 组织工程的发展与面临的挑战
    1.2 组织工程支架材料
        1.2.1 组织工程支架材料的要求
        1.2.2 支架材料的分类
    1.3 生物材料表面改性
        1.3.1 生物材料表面改性的概念
        1.3.2 生物材料表面改性的方法
        1.3.3 生物材料表面改性的意义
    1.4 明胶、多巴和生长因子用于材料表面改性
        1.4.1 明胶及其衍生物用于材料表面改性
        1.4.2 多巴及其衍生物用于材料表面改性
        1.4.3 生长因子在材料表面的固定
    1.5 立题依据和实验设计
第二章磷酸功能化明胶的制备及其性质研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要试剂与仪器
        2.1.2 P-gelatin的制备方法
        2.1.3 P-gelatin的表征
    2.2 结果
        2.2.1 P-gelatin的合成
        2.2.2 P-gelatin的表征
    2.3 讨论
        2.3.1 P-gelatin的制备
        2.3.2 P-gelatin的表征
第三章磷酸功能化明胶修饰的钛表面性质研究
    3.1 材料
        3.1.1 主要试剂
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 细胞
        3.1.4 钛片
    3.2 方法
        3.2.1 P-gelatin对钛片表面修饰
        3.2.2 P-gelatin修饰的钛表面表征方法
        3.2.3 P-gelatin修饰的钛片的细胞相容性
    3.3 结果
        3.3.1 P-gelatin修饰的钛表面表征
        3.3.2 P-gelatin修饰钛片细胞相容性
    3.4 讨论
第四章 多巴功能化表皮生长因子的制备及细胞相容性研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 主要试剂
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 细胞
        4.1.4 试剂配制
        4.1.5 EGF-DOPA的合成和二级结构检测
        4.1.6 EGF-DOPA 在材料表面的固定
        4.1.7 EGF-DOPA 的生物相容性研究
        4.1.8 统计学处理
    4.2 结果
        4.2.1 EGF-DOPA的合成和二级结构检测
        4.2.2 EGF-DOPA在胶原蛋白膜表面的固定
        4.2.3 游离的EGF-DOPA对细胞的增殖影响
        4.2.4 EGF-DOPA修饰的材料对细胞增殖的影响
    4.3 讨论
第五章 结论
本研究的特色与创新点
参考文献
在学期间所取得的研究成果
致谢

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本文编号：2839104