PTP1B磷酸化水平对SCR技术中MSCs粘附与成骨的影响和机制研究

发布时间：2020-10-14 20:38

　　 研究背景:选择性细胞滞留技术(SCR)作为骨组织工程在构建策略上的改进,已用于临床即刻构建即用型骨移植物以满足包括骨缺损修复、脊柱和关节融合等多种手术对骨移植材料的需求。细胞-支架材料的粘附是构建组织工程人工移植物的首要环节,尤其在SCR技术中,提高骨髓液中以MSCs为代表的成骨前体细胞与支架材料的粘附效率是提高SCR构建骨移植物成骨活性的关键。非受体型酪氨酸磷酸酶PTP1B是整合素介导的细胞-基质粘附和钙黏蛋白介导的细胞间粘附在通路对话中的关键枢纽,据推测,PTP1B Y152位点的磷酸化状态可能是平衡上述两组截然不同又相互关联的粘附通路的重要支点。特异性抑制PTP1B Y152位点磷酸化或可在弱化钙黏蛋白介导的细胞间粘附的同时强化整合素介导的细胞-基质粘附。方法:1)为特异性抑制PTP1B Y152位点磷酸化,选取以PTP1B Y152位点为中心的15氨基酸长度的序列,并在其C端连接11氨基酸长度的TAT穿膜结构域,以固相合成法获取26氨基酸长度的PTP1B Y152结构域模拟肽(152RM肽)及其Y152/153f突变对照肽以及FITC荧光标记的上述多肽并进行序列的准确性鉴定。2)采用激光共聚焦显微镜以FITC荧光标记的152RM肽或突变序列肽示踪其对人属骨髓来源的悬浮状态MSCs的入胞过程。设计正交实验以Western Blot检测152RM肽对悬浮状态MSCs中PTP1B Y152位点磷酸化抑制效应的时效-量效关系。3)以Western Bolt和Co-IP检测通过152RM肽干预PTP1B Y152位点磷酸化后对粘附相关蛋白磷酸化以及蛋白间结合量的影响;以抑制剂在不同层面干预、以Western Blot探索152RM肽的作用机制;以活/死细胞染色检测152RM肽的细胞相容性。4)设计“沉降粘附法”均一化细胞粘附的起始时间、观察MSCs的粘附铺展能力并在早期粘附2-10分钟准确的各个时相点提取总蛋白,以Western Blot检测细胞早期粘附中Src和FAK的磷酸化变化谱、以Pull-down实验检测细胞早期粘附中Rho家族粘附相关的关键小G蛋白Rac1、Cdc42和RhoA的活性变化谱。5)采用基于“沉降粘附法”的离心细胞粘附实验检测MSCs在早期粘附中的基质锚定能力并观察MSCs中晚期铺展铺展形态;基于优化的接种方法在MSCs早期粘附2-10分钟的各个时相点对细胞骨架染色观察其粘附形态、细胞骨架重构以及丝状伪足和板状伪足形成情况、并定量检测MSCs在20-100分钟中晚期粘附的时间-面积曲线。6)在SCR技术中使用经152RM肽预孵育的骨髓液对DBM支架材料进行富集,洗脱细胞后以流式细胞术检测CD271~+细胞、CD90~+/CD105~+细胞和有核细胞在DBM中滞留的绝对数量及其在总有核细胞中的相对占比。7)以qPCR、Western Blot、碱性磷酸酶活性检测试剂盒和CCK-8法检测152RM肽干预下MSCs成骨标志物在基因转录及蛋白表达层面的水平和MSCs的增殖能力。8)采用模拟SCR技术或传统浸渍修饰法以FITC荧光标记的152RM肽对DBM进行修饰,以激光共聚焦显微镜定量分析材料的算术平均荧光强度以检测在SCR技术的富集流程中152RM肽在材料上是否有余留量;以qPCR检测余留152RM肽对MSCs成骨分化能力的影响并与浸渍修饰法和衡量肽干预组作对比。9)提取核蛋白检测β-catenin的核定位量,采用抑制剂在Wnt/β-catenin和整合素通路不同层面干预,以Western Blot探索152RM肽诱导MSCs成骨分化的通路途径。10)采用裸鼠皮下成骨模型和裸鼠股骨旁成骨模型,经Micro-CT定量以及HE和Masson’s染色定性分析,分别检测在SCR技术中使用152RM肽预孵育骨髓对DBM富集制备的骨移植物在体内的骨形成能力。结果:1)经商业合成获取了高纯度的152RM肽、Y152/153f突变对照肽以及FITC荧光标记的上述多肽,各肽对经鉴定的悬浮状态MSCs可在60分钟内有效穿膜入胞;152RM肽对悬浮状态的MSCs在作用60分钟时对全长或酶切的PTP1B Y152磷酸化抑制的最低有效浓度可至0.33μM,且152RM肽未对MSCs显示出明显的细胞毒性。2)以152RM肽干预60分钟后,悬浮状态的MSCs中全长或酶切的PTP1B Y152磷酸化水平大幅下降、β-catenin Y654磷酸化水平显著上调,Src抑制位点Y530磷酸化水平显著下调、自磷酸化激活位点Y419磷酸化水平显著上升;总钙黏蛋白分别与全长或酶切的PTP1B本体以及β-catenin本体的结合量显著下降,突变对照肽不具备上述效应,而PTP1B的特异性抑制剂TCS-401可显著逆转上述蛋白磷酸化的改变。3)基于“沉降粘附法”的离心细胞粘附实验显示以152RM肽干预60分钟的MSCs在早期粘附中具备更强的基质锚定能力;基于“沉降粘附法”在细胞的中晚期粘附中定性观察到经152RM肽孵育的MSCs展示出更为活跃的细胞粘附和铺展能力。4)基于优化的细胞接种方法在细胞早期粘附2-10分钟的各个时相点观察到经152RM肽孵育的MSCs在更早的时间启动细胞粘附、展示出更广泛的丝状伪足和板状伪足形成并提早展示出一定的各向异性粘附形态,而PTP1B抑制剂TCS-401以及Src抑制剂Bosutinib可显著抑制上述效应;MSCs中晚期粘附的铺展时间-面积曲线显示经152RM肽孵育的MSCs在粘附20至60分钟时铺展面积显著高于Vehicle对照组,但在粘附80分钟和100分钟时两组的差异值无统计学意义。5)在2-10分钟的细胞早期粘附中,经152RM肽孵育的MSCs中Src、FAK激酶以及小G蛋白Rac1和Cdc42在粘附起始前和粘附过程中活性均高于Vehicle对照组,而晚期粘附标志的小G蛋白RhoA活性显著低于Vehicle对照组。6)以152RM预孵育的骨髓液中CD271~+细胞、CD90~+/CD105~+细胞在SCR技术中粘附滞留于DBM的绝对数量及其在总有核细胞中的占比均显著高于Vehicle对照组,PTP1B抑制剂TCS-401或Src抑制剂Bosutinib可逆转该效应。7)在成骨诱导环境中,152RM肽可上调MSCs成骨分化指标RUNX2、OCN和COL-1的基因转录和蛋白表达水平并上调ERK1/2 T202/Y204位点磷酸化水平,且152RM对贴壁MSCs的PTP1B Y152、β-catenin Y654和Src Y530/Y419磷酸化产生与在生长培养基中对悬浮状态MSCs类似的效应。8)152RM肽对MSCs在DBM上的增殖无显著作用,生长培养环境和成骨诱导环境中β-catenin的核定位量无明显改变;模拟SCR技术中余留于DBM的152RM肽可有效促进MSCs成骨分化;PTP1B、Src和ERK1/2抑制剂可逆转152RM肽对MSCs成骨分化的促进效应,但Wnt/β-catenin经典途径干预剂不能有效逆转该效应。9)以152RM肽孵育的骨髓液在SCR技术中对DBM富集制备的骨移植物在裸鼠皮下成骨模型和裸鼠股骨旁成骨模型中均展示出更好的体内骨形成能力。结论:152RM肽通过特异性抑制MSCs中PTP1B Y152位点的磷酸化水平,在弱化钙黏蛋白粘附通路的同时强化整合素粘附通路,并通过整合素通路途径促进了MSCs成骨分化。在SCR技术中采用152RM肽预孵育的骨髓液对DBM进行细胞富集有效增加了MSCs在DBM中的粘附效率及其成骨分化能力,以该方法制备的骨移植物在体内具备更优的骨形成能力,证实通过提高MSCs的自身粘附能力以增强其在SCR技术中粘附效率并提高SCR技术制备骨移植物体内成骨活性的可行性和有效性。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318
【部分图文】：

陆军军医大学博士学位论文2.2 结 果2.2.1 肽的结构示意图及序列准确性鉴定(1) PTP1B 结构域模拟肽及其突变肽的结构示意图本研究涉及的带 TAT 穿膜序列的 PTP1B 结构域模拟肽（152RM）、152RM（Y152/153f）突变肽以及 FITC 荧光标记的各肽经综合考虑其理论半衰期、生物活性和实际溶解度等方面，将 TAT 穿膜序列（YGRKKRRQRRR 序列）置于各肽的 C 端。各肽的一级结构示意图如下（图 2-1）：

陆军军医大学博士学位论文(2) 形态和多向分化能力鉴定本项目各实验中所采用的细胞均为贴壁生长的典型长梭形细胞，光镜下可见质膜立体透亮、边界明晰圆润。经成骨诱导后可见磨砂样的细胞外基质结节和矿化沉积，可由茜素红深染；经成软骨诱导后可见薄层胶体样的细胞外基质沉积，可由甲苯胺蓝深染；经成脂诱导后以油红 O 染色可见胞内大量红染的脂滴聚集。上述结果显示细胞可被成功诱导向骨、软骨和脂细胞方向分化。结合流式细胞术结果，本项目各实验中所采用的细胞在生物学特征上符合 ISCT 对人间充质干细胞的描述[29]，可鉴定为合格的间充质干细胞（图 2-4）。

陆军军医大学博士学位论文光、胞质可检测到分布不均匀的低强度荧光；在孵育 30 分钟时，MSCs 胞质出现分布不均匀的荧光、核膜出现明显的荧光聚集并继续累积至核内；在孵育 60 分钟组多肽均已在胞质大量积累，其中 152RM 肽在 MSCs 胞质的分布不均匀、呈现定的网格状分布，而突变对照肽在 MSCs 胞质的分布较为均匀（图 2-5）。
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本文编号：2841160