氧化石墨烯作为牙再生支架的可行性研究
发布时间：2020-10-17 07:55
目的本课题旨在分析细胞在氧化石墨烯(graphene oxide,GO)支架上附着、生长和钙化能力,探索GO支架的生物相容性及其作为新型牙再生支架的可行性。方法1采用改良组织块法培养大鼠牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)并采用CD34、CD44和STRO-1抗体进行免疫荧光染色鉴定。采用酶消化法培养胎鼠下颌突的牙源性上皮细胞(dental epithelial cells,DECs)并采用CK14抗体进行免疫荧光染色鉴定。2采用Hummers法和梯度冷冻干燥法制备三维GO支架,通过扫描电镜观察支架表面形态,拉曼光谱仪进行材料成分测定。3将DPSCs分别接种到α-MEM培养基(对照组)和含有不同浓度GO分散液的培养基(实验组)内,24小时后通过MTT法检测各组吸光度,计算出细胞成活率,以分析GO是否有细胞毒性。4将GO支架放入有DPSCs细胞的培养基培养3天,用免疫荧光染色法检测tubulin-β,以观察细胞在支架上的附着情况。5按照分层接种法将DPSCs和DECs按照1:1的比例接种到GO支架(DPCSs/DECs/GO组)和明胶海绵支架(DPCSs/DECs/GS组)上,在体外构建上皮—间充质干细胞立体培养模型并移植到大鼠大网膜内。4周后取材,行组织学观察和牙本质涎蛋白(Dentin sialoprotein,DSP)的免疫组化染色,检测移植物内组织的生成状况。采用扫面电镜观察移植物内组织形态,能谱仪测定移植物内钙磷元素含量,X线衍射仪测定移植物组织结构,与正常牙齿进行对比,检测矿化程度。动物体内实验是为了活体分析细胞在GO支架上的分化能力。结果1培养所得牙髓细胞不表达造血干细胞表面标记物CD34,阳性表达间充质干细胞表面标记物CD44和STRO-1,证实该细胞为DPSCs。培养所得下颌突细胞阳性表达上皮细胞标记物CK14,证实该细胞为DECs。2 GO支架表征学测定结果表明,该支架孔径为50-100μm,孔隙率高达95%,表面有皱褶结构;拉曼光谱结果显示,D峰出现在1355cm-1,G峰出现在1582cm-1,符合GO的特点。3 MTT实验结果显示,GO分散液组细胞活性与α-MEM组无显著性差异(P0.05),说明GO无细胞毒性。4免疫荧光结果显示DPSCs细胞在GO支架上生长良好,能够很好地黏附和伸展。说明GO具有良好的生物相容性。5动物体内实验结果:HE染色显示每组支架均有新生组织长入,细胞生长良好,DPCSs/DECs/GO组可见均质红染的钙化物质形成;免疫组化染色可见DPCSs/DECs/GS组DSP阴性表达,个别地方呈弱阳性。而DPCSs/DECs/GO组DSP呈强阳性;扫描电镜图像可见DPCSs/DECs/GO组内有胶原和血管形成,细胞生长良好。能谱仪检测结果显示移植物内有少量钙磷物质表达,X线衍射仪结果可见移植物尚未达到正常牙齿的矿化水平,说明矿化程度较低。动物实验结果表明与GS相比GO支架更有助于DPSCs分化。结论1采用改良组织块法能够获得大鼠DPSCs;采用酶消化法可以培养出胎鼠DECs。2 GO支架具有良好的生物相容性,有利于DPSCs的生长与附着。3 GO作为牙再生新型支架,对DPSCs体内牙向分化具有一定的促进作用。图14幅;表1个;参110篇。
【学位单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：
P<0.05 表示各组数据差异具有统计学意义。.3 实验结果.3.1 石墨烯支架的表征测定SEM 结果显示，采用梯度冷冻干燥法获得的 GO 支架具有多孔结构，孔径0-100μm(图 6A 左)，孔隙率高达 95%，同时放大倍数后可以发现，支架表面有皱褶(图 6A 右)，皱褶结构更有利于细胞的黏附。拉曼光谱是一种散射光谱，用的，具有高分辨率的表征碳材料的技术，通过波峰的位置，强度和形状，可材料成分进行鉴定。GO 拉曼光谱主要有 D 峰和 G 峰，D 峰一般出现在 1350c 附近，是由 SP2 的无序震动引起；G 峰在 1580cm-1 附近，于碳原子面内震动的。本实验 GO 拉曼光谱结果显示(图 6B)，D 峰出现在 1355cm-1，G 峰出现582cm-1，符合 GO 的特点；75%酒精浸泡消毒后的 GO 拉曼光谱同消毒前，说5%酒精未对 GO 性能造成影响。
两组数据比较采用 t 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义。实验结果移植物的组织学观察内移植(图 8)后，所有动物均按时苏醒，生命体征正常，3 天后精神。移植物移植 4 周全部后取出，肉眼可见每组标本均被纤维结缔组织包S 组完全被吸收，未采集到标本。HE 染色可见其余三组细胞生长状具有良好的生物相容性；DECs+DPSCs/GO 组可见 GO 支架孔隙内有个别区域可见少数深染钙化灶，局部放大可见均质红染的钙化结构；DECs+DPSCs/GS 组中 GS 支架已被吸收，无支架结构剩余，绝大多结构，未见钙化区域，血管生成较少(图 10B)；GO 组可见细胞聚集在大多数为长入的纤维结缔组织(图 10C)。所有组均未见典型的牙髓牙本
- 26 -注：各组 DSP 平均光密度值比较，* P<0.05。图 12 各组 DSP 平均光密度值比较.12 Comparison of the average optical density of DSP in each group扫描电镜观察结果镜可以观察到正常牙齿的釉牙本质界，釉柱，牙本质小ECs/GO 组可以清晰地观察到大量排列无序的胶原形成管(图 13)。表明 GO 支架具有良好的生物相容性。移植形态有类似之处，加之有小血管生成，可以推测该组织趋势，但暂无明确验证指标，该结果只能作为参考。
【参考文献】
本文编号：2844507
【学位单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：
P<0.05 表示各组数据差异具有统计学意义。.3 实验结果.3.1 石墨烯支架的表征测定SEM 结果显示，采用梯度冷冻干燥法获得的 GO 支架具有多孔结构，孔径0-100μm(图 6A 左)，孔隙率高达 95%，同时放大倍数后可以发现，支架表面有皱褶(图 6A 右)，皱褶结构更有利于细胞的黏附。拉曼光谱是一种散射光谱，用的，具有高分辨率的表征碳材料的技术，通过波峰的位置，强度和形状，可材料成分进行鉴定。GO 拉曼光谱主要有 D 峰和 G 峰，D 峰一般出现在 1350c 附近，是由 SP2 的无序震动引起；G 峰在 1580cm-1 附近，于碳原子面内震动的。本实验 GO 拉曼光谱结果显示(图 6B)，D 峰出现在 1355cm-1，G 峰出现582cm-1，符合 GO 的特点；75%酒精浸泡消毒后的 GO 拉曼光谱同消毒前，说5%酒精未对 GO 性能造成影响。
两组数据比较采用 t 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义。实验结果移植物的组织学观察内移植(图 8)后，所有动物均按时苏醒，生命体征正常，3 天后精神。移植物移植 4 周全部后取出，肉眼可见每组标本均被纤维结缔组织包S 组完全被吸收，未采集到标本。HE 染色可见其余三组细胞生长状具有良好的生物相容性；DECs+DPSCs/GO 组可见 GO 支架孔隙内有个别区域可见少数深染钙化灶，局部放大可见均质红染的钙化结构；DECs+DPSCs/GS 组中 GS 支架已被吸收，无支架结构剩余，绝大多结构，未见钙化区域，血管生成较少(图 10B)；GO 组可见细胞聚集在大多数为长入的纤维结缔组织(图 10C)。所有组均未见典型的牙髓牙本
- 26 -注：各组 DSP 平均光密度值比较，* P<0.05。图 12 各组 DSP 平均光密度值比较.12 Comparison of the average optical density of DSP in each group扫描电镜观察结果镜可以观察到正常牙齿的釉牙本质界，釉柱，牙本质小ECs/GO 组可以清晰地观察到大量排列无序的胶原形成管(图 13)。表明 GO 支架具有良好的生物相容性。移植形态有类似之处，加之有小血管生成，可以推测该组织趋势，但暂无明确验证指标，该结果只能作为参考。
【参考文献】
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本文编号：2844507
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