压缩载荷下人工关节软骨的构建及软骨缺损修复的研究

发布时间：2020-10-18 20:27

　　 在关节的活动当中,膝关节软骨是其中重要的一个组成部分,它的健康与否直接影响到人们平时的生命活动。由于软骨的独特结构,没有血液供应,导致一旦发生了损伤,很难通过自身恢复。当前阶段采用的针对软骨损伤的修复手段成效都不理想,组织工程在软骨修复中的应用,软骨缺损的治疗带来了新的曙光。所以探索新型的软骨工程材料来进行膝关节软骨缺损治疗是极其需要的。本文应用软骨细胞外基质之一II型胶原蛋白和目前修复采用的热点材料丝素蛋白为基础材料。由于二者在单独作为修复材料是都有其明显的缺点,所以通过将其二者的复合改性作为修复材料。首先通过前期建立的方法,在天然蚕丝中提取出丝素蛋白溶液和新鲜的牛肩胛骨制备出II型胶原蛋白。配制丝素蛋白和II型胶原蛋白不同配比的复合蛋白膜(SF50,SF70,SF90),通过表观物理性能,力学性能,生物相容性来测试最佳的配比。首先通过添加去离子水调整三种配比材料具有共同的干湿比。通过冷冻干燥机和室温下晾干获得不同形态的复合膜进行测试。晾干后的复合膜利用Instron万能力学试验机测试三种配比的复合膜的力学性能,并且通过建立本构模型来验证力学实验数据。之后检测不同配比的冻干后复合膜的吸水率和降解率,然后接种软骨细胞ADTC-5,通过活死细胞双色荧光染色、MTT法和SEM观察来检测II型胶原/丝素蛋白不同配比复合膜的生物相容性。结果显示,丝素蛋白和II型胶原蛋白配比为7:3时,复合膜表现出更加稳定的物理性能以及更加优越的力学性能,本构模型和力学实验数据也展现出了相对一致的拟合。通过生物相容性的检测,SF70复合膜表现出了软骨细胞最大的增殖量。说明SF70复合膜这个配比适合作为后期软骨修复的配比。前一阶段不同配比复合膜验证实验完成后。利用SF70这个配比的混合材料进行过滤去除气泡,通过低温生物3D打印机制备,经真空状态下冷冻干燥成型,之后对支架进行去酸和co60辐照灭菌处理。经过孔隙率测试后,在灭菌好的支架上,接种软骨细胞ADTC-5,进行复合培养。本文中创新性的引入力学载荷,通过验证梯度压缩应变(0%,5%,10%,15%,20%)对复合支架进行循环压缩加载的作用,得到了适合细胞增殖的最适压缩应变为10%。在10%的压缩应变下,循环加载1天,3天,5天和7天后,分别都通过MTT,扫描电镜观察,PCR荧光定量,HE染色观察。在10%的压缩应变下,对支架和细胞进行组织化培养,通过扫描电镜观察,发现随着动态培养天数的增加,软骨细胞在复合支架上的数量越来越多,细胞基本外基质连接在一起,几乎覆盖了整个支架表面。MTT,HE染色从数量上,Real-time PCR从基因表达上,Western Blot从蛋白分泌是印证了细胞数量上的增长。最后根据前期的实验基础,用限位器将支架制备成直径3.5mm的圆柱体。同时用限位器将3-4月龄的新西兰大白兔关节软骨股骨端制备出直径3.5mm的圆形缺损。之后将圆柱体支架植入到圆形缺损中,手术缝合后,饲养2周,4周,6周和8周,对新西兰白兔采用耳缘静脉注射空气栓塞的方法处死,之后取出修复区域,通过Micro-CT扫描,HE染色和免疫组化染色,来观察缺损区域的修复情况。结果显示肉眼可以看出随着修复过程的进行,支架逐渐降解消失,新的软骨开始形成。Micro-CT的结果展示出支架不仅表现出对软骨的修复,发现软骨下骨也开始发生修复效果,这为后期进行透明软骨层-软骨钙化层-软骨下骨的分层修复整合提供了实践经验。组织学和免疫组化的染色展现出了新的软骨及软骨下骨开始形成。综上所述,通过自我探索的寻求验证,配比7:3的丝素蛋白/II型胶原蛋白混合材料对软骨细胞的增殖生长以及软骨缺损的修复表现出极大的潜力和可能,有望作为后期组织工程修复软骨缺损的新型复合材料。
【学位单位】：天津理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R318.17
【部分图文】：

第一章 绪论1.1 课题研究的背景及意义关节软骨（Articular cartilage，AC）是骨关节中非常重要的组成部分，是一种富骨细胞及其外基质的无血管结缔组织，其中的软骨外基质主要包括二型胶原蛋白、高分子的聚集蛋白聚糖以及极度亲水的透明质酸。AC 具有层区纤维特征的非均构，从表层区、中层区、深层区、软骨钙化层至软骨下骨，都有着不同的细胞和分构，呈现出不同的生化和形态特征（见图 1-1）。在日常的生命活动中，关节软骨围充满着复杂的应力环境，在骨关节的活动中，软骨充当着一个具有低摩擦的界面表面承受的载荷均匀通过关节软骨传递到下骨部分，为关节的活动发挥着保护和支作用。

2.2.3 丝素蛋白溶液的提取使用托盘天平称取天然蚕丝 100g，将 4L 去离子水煮沸后，加入无水碳酸钠配制成质量分数为 5%的碳酸钠水溶液，放入天然蚕丝后煮沸 30min。取出蚕丝在去离子水中清洗干净，将煮后浑浊液体弃除后，重新在 5%的碳酸钠水溶液中沸煮洗涤蚕丝两次。将洗净后的桑蚕丝挤干水分，平铺在烘箱内，设置温度 60 烘干 4 小时。用托盘天平分别称取三者摩尔比例为 1:8:2 的无水氯化钙、去离子水和无水乙醇，先将无水氯化钙充分溶解在去离子水中，带温度冷却至 60℃时，倒入三孔瓶中，加入无水乙醇后，置于恒温水箱中，设置恒定保持温度为 60℃。将烘干后蚕丝充分剪碎后，用镊子依次放入三孔瓶中，在 60℃水浴下，通过搅拌机搅拌 4 小时。将溶解后的蚕丝溶液倒入洗净的透析袋中，通过流动的自来水透析 2 天后，用去离子水浸泡透析，每隔 4h 换一次水，透析 24h，以去除丝素溶解液中的 Ca2+、Cl-等离子。用聚乙二醇 20000 覆盖在透析后的透析袋上进行浓缩，等丝素溶解液浓缩成原体积的三分之一后，用去离子水洗净透析袋。取干净的离心管倒入浓缩后的丝素溶液，设置 8000r/min 的转速，15min 的离心时间，之后收集离心后溶液的上清液，在 4℃冰箱中密封保存。丝素蛋白提取的过程如图 2-1 所示。

第二章 丝素蛋白/II 型胶原复合膜的力学性能和力学行为的本构描述洗 3 次，加入含胃蛋白酶（1mg/mL）的冰醋酸溶液，溶解 72h。溶解后倒入离心瓶中，用托盘天平配平后，设置 8000r/min 的离心速度和离心时间 10min，离心后取上层清澈的液体。加入预先配置好的 0.5M 的氢氧化钠溶液至 PH 值为中性，再加入 NaCl 晶体，析出胶原絮状体，装入透析袋中去离子水中透析 4 天。透析过后通过进行离心去除上清液后进行浓缩。收集剩下沉淀，在-20℃冰箱中保存密封。II 型胶原蛋白提取的过程如图2-2。
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本文编号：2846768