新型个体化组织工程骨的构建及体内外成骨作用的实验研究

发布时间：2020-11-01 01:03

　　 研究目的:本课题旨在应用3D打印技术制备聚己内酯(PCL)支架,协同富血小板血浆(PRP)和骨形态发生蛋白2(BMP2)的促成骨作用,构建具有良好骨修复能力的个体化复合组织工程骨。研究方法:通过3D打印技术构建不同孔隙率的PCL支架并进行力学性能、孔隙率等相关检测。利用Landesberg二次离心法获取富血小板血浆(PRP),通过血小板计数、电镜观察、HE切片染色等方法表征。利用冷冻干燥法制备PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨。采用全骨髓贴壁法获取、分离、培养新西兰大耳白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),定期观察其生长状态,通过成骨、成脂肪、成软骨细胞“三系”分化及Western Blot、免疫荧光等检测方法进行鉴定。体外细胞水平观察PRP/BMP2协同促成骨分化能力,设立不同的分组:空白对照组、PRP组、PRP/BMP2组、成骨诱导液组,通过碱性磷酸酶染色、茜素红S染色法、PCR法检测成骨相关基因ALP、OCN的表达观察实验组促进成骨分化的能力。体外水平观察组织工程骨的促成骨分化及BMSCs的增殖能力,设立分组:单纯PCL支架(普通培养基组)、PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组、单纯PCL支架(成骨诱导液组),对各组碱性磷酸酶(ALP)活性进行测定,通过MTT法观察在单纯PCL支架(普通培养基组)、PCL/PRP复合支架、PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨中BMSCs的增殖情况。建立新西兰大白兔桡骨中段长15mm的骨缺损模型,共48只,分4组(每组6×2只)。设立分组:空白对照组、单纯PCL支架组、PCL/PRP复合支架组和PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组。分别在第4周和第12周获取组织标本进行大体观察和X线片观察骨缺损修复情况,并用Lane-sandHu X线评分法对12周的X线结果进行评分;组织切片行苏木精伊红(HE)和Masson三色染色进一步观察复合组织工程骨在组织学水平的骨修复效果。研究结果:通过3D打印技术可获取合适孔隙率及力学性能的PCL支架;通过Landesberg二次离心法可获取理想的富血小板血浆;通过冷冻干燥法可制备PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨。全骨髓贴壁法获得的兔BMSCs在镜下呈梭形且贴壁生长的细胞,培养过程中状态稳定;该细胞系在体外诱导条件下可向成骨、成脂肪及成软骨细胞分化,具备多功能干细胞的特点;表面标记物检测发现此细胞系表达CD29、CD44,不表达CD34、CD14。体外细胞水平观察各组促成骨分化的实验发现PRP/BMP2组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色的程度最高;且成骨相关基因OCN和ALP的mRNA表达水平明显高于空白对照组、PRP组及成骨诱导液组;PCL/PRP/BMP2复合组织工程骨组碱性磷酸酶蛋白(ALP)的活性定量明显高于空白对照组、PRP组及成骨诱导液组;在PCL/PRP复合支架中培养的BMSCs隔日MTT法所测的OD高于其他组。动物实验的大体观察及X线检查结果显示4周及12周时PCL/PRP/BMP2组中骨缺损区域新生骨明显优于PCL组、PCL/PRP组;12周时PCL/PRP/BMP2组的Lane-sandHu X线评分显著高于其余各组;HE染色及Masson染色结果进一步显示4周及12周时PCL/PRP/BMP2组新生骨组织明显多于PCL组、PCL/PRP组;而空白对照组两侧断端骨性闭合,骨缺损区少量骨组织生长,无法实现自我修复。研究结论:应用3D打印技术结合富血小板血浆和骨形态发生蛋白2可实现个体化复合组织工程骨的构建,此复合组织工程骨具有良好的骨修复能力,有望成为个性化修复临床骨缺损的方法之一。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R68;R318.08
【部分图文】：

图1.1：Landeaserg两次离心法提取PRP（待鉴定）RP的鉴定RP中血小板计数 12 只实验兔采血，酒精棉球在耳缘静脉处消毒 2 次，揉搓抽取静脉血注入抗凝真空管内，以测定兔全血血小板。制备时同时抽取的兔全血与兔的PRP一同在血细胞分析仪中证制备的PRP数量是否与文献一致（PRP中血小板是全血的描电镜观察（SEM）血小板血浆约 2-3ml，摇匀后加入 0.4ml 激活剂（激活剂为 1000u 凝血酶混合而成），约 4-5 分钟后形成凝胶状物质，，随后置于-80℃中冷冻，待冷冻完全后迅速转入冷冻干燥后于-20℃中保存备用。利用扫描电镜观察 RPR 的微观形

为研究PCL支架外观形态，我们采用相机拍摄观察，当原材料加入MAM系统后，升温使之熔融，调整3D打印机参数条件，根据设计的STL文件路径构建出PCL支架，大体外观（图1.2）可见PCL支架内部结构匀称、规则，可按设计结构实现个体化PCL支架打印。图1.2：PCL支架的大体外观。2．不同PCL支架孔隙率的测定根据PCL柱间距（600μm、800μm和1000μm）分别打印支架，3种不同间距的PCL支架材料孔隙率测定结果如下，随着PCL柱间距增大，孔隙率逐渐增高。表1：不同移动间距打印支架的孔隙率，任意两组间比较P均小于0.05Material n 均数±标准差PCL(600) 6 29.70±1.14PCL(800) 6 53.93±1.70PCL(1000) 6 60.48±1.153．PCL支架的扫描电镜(SEM)结果为研究原材料在MAM形态中打印的情况，利用SEM对支架进行微观观察，结果显示（图1.3）：MAM系统可将PCL材料通过层层堆叠（layer-by-layer）方式形成孔隙率均匀、孔隙间互通的三维支架结构。

图1.3：PCL支架的扫描电镜图（A: 正面观，240×；B: 侧面观，240×）4．力学性能测定不同PCL柱间距（600μm、800μm、1000μm）的支架（图1.4，表2），当形变率达到50%时，600μm和800μm时可承受的应力强度值分别为12.4±0.64 MPa、11.76±0.77MPa，两者无明显差异，而1000μm时可承受的应力强度值为4.82±0.67MPa，较强两者明显减小，与前两组有统计学差异，P＜0.05。图1.4：不同PCL柱间距支架的应力-形变曲线。表2：形变率达到50%时，不同柱间距的支架所呈现的应力强度（compressive strength）Material n 均数±标准差PCL(600) 5 12
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本文编号：2864785