表皮干细胞装载喷洒装置促进损伤皮肤修复再生的研究

发布时间：2020-11-07 13:10

　　 皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成,是人体对抗外部环境的一层天然保护屏障。当皮肤遭到机械损伤、化学品危害以及细菌真菌侵入时,人体就会失去这层保护屏障,机体也会启动应激反应促进皮肤功能恢复。针对不规则、大面积以及深浅不一的皮肤创伤,目前的主要治疗策略为采用网状移植或者组织工程产品的异体或异种脱细胞基质敷料进行移植,其具有较低的免疫原性和良好的组织相容性,机械性与正常皮肤极其相近,是理想的生物辅料,但敷料与深浅不一的损伤部位贴合性不佳,容易造成空腔,使得并发症的发生率提高。因此,本课题中,我们通过一种创新的细胞喷洒装置,用于进行细胞喷雾移植促进损伤后的表皮再生,形成一种特殊形式的组织工程皮肤。结合交叉学科优势,自主研发同时可以装载自体皮肤细胞和脱细胞猪皮基质粉的喷洒装置用于皮肤创伤治疗。探讨细胞喷洒系统作为组织工程产品对皮肤损伤修复的意义。因此,本课题可分解为三个部分。第一部分中,我们重点评估了细胞喷洒装置对于细胞的影响,验证了皮肤喷枪的优势与可应用性;第二部分重点在于通过建立一种温和、高效的原代表皮干细胞(human keratinocytes stem cells,hKSCs)分离方法,构建足以使体外规模化扩增的三维培养方案,提供足够数量的种子细胞;第三部分,通过体外生物酶解和冷冻机械研磨方法,获得高纯度且保留生物活性的脱细胞猪皮细胞外基质粉末(Decellular porcine skin extracellular matrix powder,ECMP)制备,作为细胞移植的液体载体促进表皮细胞和成纤维细胞参与损伤修复,同时探索ECMP对表皮和成纤维细胞生长的支持作用及两者对皮肤创伤修复的促进作用。1.细胞搭载喷枪的生物学检测我们设计不同类型细胞装载喷洒,证明喷洒过程对于细胞数量、分布和活性并没有影响,喷洒过程对细胞功能执行不会产生影响。确定了喷洒装置通过Live/Dead染色以及免疫荧光等结果可以发现,喷洒装置可以实现雾化效果,液滴均匀化分布;喷洒后液滴内的细胞具有高活性,并随着雾化效果同样均匀分布。对不同细胞类型与不同浓度的细胞外基质重悬到一起后装载喷洒后,结果显示,细胞可以快速粘附并伸展。2.表皮干细胞作为种子细胞储备我们摸索创新了快速、温和酶组合的消化方法,可以得到具有高活性的表皮干细胞。建立了一种对表皮干细胞进行无滋养层、无血清的三维培养体系,结果表明,体外扩增6代以内的倍增时间稳定维持在52小时左右,为后期进入临床的细胞移植得到足够数量的表皮细胞。这样培养方式下扩增起来的表皮干细胞活力状态非常好,通过透射电镜结果可以清楚看到分泌小泡,以及大量形成了具有表皮特有的桥粒连接。组织学结果检测发现,细胞球高表达再生相关蛋白K14、增殖蛋白P63、Ki67以及上皮细胞连接E-cad、Claudin1。对表皮干细胞体外长期培养鉴定发现,细胞装载喷洒后可以在体外形成假复层;经鉴定,复层的最下面一层细胞高表达再生标志蛋白ITGA6、K14,说明了喷洒后的细胞在体外非常好地执行增殖分化功能。在NOD/SCID全免疫缺陷小鼠的背部建立全层切除皮肤伤口模型,损伤后将富含表皮干细胞的细胞聚集体装载皮肤喷枪并均匀喷洒于创面局部,移植治疗后观察细胞在伤口处的归巢和整合。NOD/SCID小鼠的体内移植实验证明,分离培养的人表皮干细胞喷洒伤口后,在第7天与对照组相比就开始明显快速恢复,证明移植的细胞具有高活性并在体外存活时间长,分泌刺激伤口加速愈合。3.脱细胞真皮基质搭载喷洒装置促表皮和成纤维细胞参与创伤修复经过生物酶法脱细胞、冷冻干燥后-80℃保存备用;经过不同冷冻研磨程序得到ECMP,再由钻-60辐照获得无菌基质粉;通过观察ECMP颗粒分布特性,确定适合应用的冰冻研磨程序;通过研究不同浓度ECMP对细胞的促黏附作用,确定ECMP的使用浓度范围;通过检测ECMP对成纤维细胞的促迁移和对表皮细胞的促增殖作用,证实ECMP对创伤修复的重要作用;通过免疫荧光检测细胞表面成熟与分化蛋白的表达,分析在与ECMP共培养时,原代表皮角质细胞成熟及干性维持的水平。以上实验数据表明本课题所使用的喷洒装置,在喷洒后对细胞生物学功能的影响做了全面细致的研究,验证了喷洒过程不仅对细胞的活力无影响,对细胞在体外增殖、分化和迁移等功能的发挥也无影响。确保了建立的细胞移植系统顺利使用推广。对分离培养获得的表皮干细胞(hKSCs)的生物学特性进行鉴定表明细胞在体外同样具有扩增潜能,为规模化扩增奠定基础。同时,做到了完善的无血清、无滋养层的三维培养条件;使用临床级别Knockout SR作为血清替代物,稳定获得功能完善的细胞。细胞外基质在伤口恢复过程中可以最大限度的保留细胞培养时分泌的各种营养因子随着细胞增殖迁移,创面再表皮化加速。本课题摸索建立后发现,在冷冻研磨程序7次循环下,获得的ECMP粒径均小于15μm,可达到应用的要求,ECMP以500 μg/cm2浓度包被培养板,能够显著促进成纤维细胞的迁移,并且促进表皮细胞增殖并维持其干性。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318
【部分图文】：

实验结果??１．喷洒装置喷洒性能检测??前言提到了通过皮肤组织工程进行创伤修复，具体设计如图１－１，表皮单位??的体外扩增后，重悬在细胞外基质（ＥＣＭ）装载皮肤喷枪，电动方式喷洒并完??全覆盖住不规则创伤面，填充不同深度的组织中。ＥＣＭ促细胞活力，提供支撑，??创造细胞快速迁移以及加速信号传递微环境。ＥＣＭ的存在最大的优势是在伤口??恢复过程中可以最大限度的保留细胞培养时分泌的各种营养因子随着细胞增殖??迁移，创面再表皮化完全。??．?ｊ?．皮枪?．．．．表皮单位＋ＥＣＭ??电也：便携性?＿??１Ｊ?Ｖ??惠?ＴＯｅｃｍ??「１?椒?ｆ—?１—＾??＇不规则创面??＊＊?—??抆杈单怔?ｙ?琅悬细胞＋ＥＣＭ?ｔｆ殯分化的细胞群??增殖、迁移和分化??、????图１－１建立一种新型灵活的细胞移植系统用于创伤修复??喷洒的液滴尺寸是衡量喷洒设备性能的一个重要因素，与注射器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）??相比较，分别喷洒ＰＢＳ溶液、ＨａＣａＴ细胞悬液，在显微镜下观察液滴粒径、细??胞分布。从图１－２的结果可以看到喷枪的液滴直径在５０＃ｎ左右，大小一致、细??第１０贞??

－??ＢＨＫ??图１－２喷洒液滴雾化效果、均匀程度的对比??上面两张为明场下喷枪（Ｓｐｒａｙ）和注射器（Ｉｎｊｅｃｔｏｒ）喷洒ＰＢＳ的液滴大小，标尺为ｌｍｎｉ：??下图为ＨａＣａＴ细胞系用ＤＡＰＩ染核之后分别喷洒的荧光图。??对喷枪性能检验的另一因素是喷洒范围与均匀度的关系，ＨａＣａＴ细胞用??Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色Ｊｒｉ装载喷枪垂直喷洒，如图１－３所示ａ、ｂ、ｃ三个［Ｘ域内细胞数??相差不人，ｉｌＥ明细胞的分布具Ｗ很好的均匀性。??ａ?ｂ?ｃ?ａ：?０－２?ｃｍ??＜?￣?ｍ?？?ｂ：?２－４?ｃｎｉ??ｃ：?４－６?ｃｍ??■■■??图１－３喷洒范围内细胞的均匀分布荧光图??第１１贞??

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【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Abu Bakar Mohd Hilmi;Ahmad Sukari Halim;;Vital roles of stem cells and biomaterials in skin tissue engineering[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

本文编号：2873993