纯钛表面DOPA-IGF1涂层对rBMSCs成骨分化影响的研究

发布时间：2020-11-11 05:08

　　 目的:制备纯钛表面重组人生长因子DOPA-IGF1涂层,构建钛片表面同时兼备促进细胞早期黏附状态和成骨活性的单一材料涂层。研究DOPA-IGF1对钛片表面兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,以期为种植体表面改性提供新的研究方向。方法:1、对携有重组人生长因子DOPA-IGF1目的基因的菌种进行表达和纯化,通过SDS-PAGE电泳水凝胶对纯化后蛋白DOPA-IGF1进行鉴定。2、利用对目标蛋白DOPA-IGF1的羟化,将其固定在钛片表面,构建涂层体系。通过扫描电镜(SEM)观察各组钛片的表面形貌、X线能谱分析(EDX)测定各组试样表面元素组成,对各组钛片进行表征。3、采用全骨髓贴壁法提取兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs),传代培养至第三代时通过细胞增殖实验(CCK-8)测定增殖曲线,对其进行成骨诱导后,通过茜素红染色和成骨相关基因检测验证其成骨分化潜能。4、通过CCK-8实验、荧光染色检测各组涂层钛片,研究DOAP-IGF1对rBMSCs增殖和早期粘附状态的影响。5、通过碱性磷酸酶(ALP)实验对共培养成骨诱导后ALP表达水平的测定和对成骨相关基因Runx2、BMP2、Col-a1相对表达量的测定,探究DOPA-IGF1对rBMSCs成骨相关活性的影响。结果:1、成功提取并培养兔骨髓间充质干细胞,显微镜下观察细胞呈长梭形有序排列,成骨诱导后验证了其成骨分化潜能。2、扫描电镜、X线能谱分析结果表明,本实验成功在钛片表面制备DOPA-IGF1涂层,并表现出理想的涂层形貌。3、CCK-8实验结果显示,细胞增殖速率为DOPA-IGF1组IGF-1组TI组(P0.05),TI组与CG组增殖率无显著差别(P0.05)。结果表明,本实验所用钛片对rBMSCs的生长无明显影响,DOPA-IGF1涂层能够显著促进钛片表面rBMSCs的早期增殖。4、荧光染色结果显示,IGF-1组与TI组细胞形态相近,呈团块状,激动蛋白微丝不清晰;DOPA-IGF1组细胞较其他两组细胞伸展出的伪足多,肌动蛋白微丝清晰可见,细胞延展性更好。5、ALP实验结果显示,随细胞培养时间延长,四组细胞的碱性磷酸酶活性逐渐增强。碱性磷酸酶活性DOPA-IGF1组IGF-1组TI组,TI组与CG组无显著差别,DOPA-IGF1组与IGF-1组差异显著(P0.05),DOPA-IGF1组与TI组和CG组相比差异显著(P0.05)。6、成骨相关基因检测结果显示,在成骨诱导4、7d时DOPA-IGF1组3种成骨相关基因表达均增强,且与其他组相比差异显著(P0.05)。结论1、成功提取并培养兔骨髓间充质干细胞并对其鉴定,结果显示实验所提取细胞的生物学特性与干细胞相符合。2、成功构建覆DOPA-IGF1及覆IGF-1涂层的实验组件,通过扫描电镜与X线能谱分析对涂层进行表征。3、通过细胞实验证明DOPA-IGF1对rBMSCs早期增殖的促进作用,初步证实其促成骨作用,但其促成骨机制和效果尚需进一步研究。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：

第 3 章 实验结果 兔骨髓间充质干细胞提取、培养和鉴定.1 rBMSCs 提取和培养结果显微镜下观察原代（P0）rBMSCs 生长缓慢，多表现为散落、三角形形态，其间混有圆形、类圆形杂质细胞，见图 3.1（代（P3）rBMSCs 生长速度明显加快，细胞集落间相互融合密排列，呈辐射状或菊花状，细胞大小形态均匀，呈长梭形3.1（B）。

显微镜下观察 rBMSCs 成骨诱导后茜素红化结果 Ni-NTA 填料的亲和层析柱进行纯化依然留有高浓度的咪唑。使用填料为脱盐纯化。蛋白表达和纯化过程中的检测分析。DOPA-IGF1 的理论分子子量一致，DOPA-IGF1 以可溶状态表白浓度为 498.63ug/ml。结果表明，本长因子 DOPA-IGF1。

图 3.2 倒置显微镜下观察 rBMSCs 成骨诱导后茜素红染色（×100）3.2 蛋白表达纯化结果上清液经过 Ni-NTA 填料的亲和层析柱进行纯化。表达和纯程后，蛋白质中依然留有高浓度的咪唑。使用填料为 Sephadex 脱盐柱进一步脱盐纯化。蛋白表达和纯化过程中的所有组分SDS-PAGE 电泳检测分析。DOPA-IGF1 的理论分子量是 10.7kd 泳图中的蛋白分子量一致，DOPA-IGF1 以可溶状态表达，见图 BCA 法测定蛋白浓度为 498.63ug/ml。结果表明，本实验成功表纯化了重组人生长因子 DOPA-IGF1。
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本文编号：2878788