脱细胞基质负载IPFP-SC修复兔骨软骨缺损的相关研究

发布时间：2020-11-13 02:51

　　 第一部分:脱细胞骨软骨基质支架的制备及相关研究目的:制备多种兔脱细胞骨软骨支架,并对这些支架进行脱细胞效果、成份、结构与生物力学测试等研究,为组织工程构造骨软骨复合物建立基础。方法:利用物理、化学、酶类联合脱细胞方法,对兔股骨滑车关节和肋骨软骨整体进行脱细胞处理,获得整体骨软骨支架,将兔股骨滑车关节和肋两个部位骨软骨按照透明软骨、钙化软骨层、软骨下骨三层结构进行分离粉碎,对三层微粒进行脱细胞处理,重新交联制备关节和肋来源的分层骨软骨支架。对整体骨软骨支架进行组织学染色,荧光比色法对整体支架各分层微粒进行残留DNA含量测定,验证脱细胞程度。利用氨基酸分析仪和荧光比色法对三层微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)进行定量分析,XRD衍射仪对羟基磷灰石进行定量分析,并与天然骨软骨进行对比。检测三种支架密度、孔隙率、孔径、吸水率等物理参数,拉扭复合力学测试机检测三种支架在干燥、湿润状态下的弹性极限、强度极限、弹性模量、脆性等力学机械性能,并和天然骨软骨进行对比。结果:本方法脱细胞程度较为彻底。相比天然骨软骨组织,脱细胞过程损失了约20~30%的氨基酸,损失了30~40%的GAG,但无机物并无损失。相比整体支架,分层支架的密度较小,孔隙率、孔径、吸水率更大。相比天然骨软骨组织,无论干燥或湿润状态,两种支架机械性能均差,且分层支架差距更大。结论:本研究联合脱细胞效果较为彻底,但有机成分有所损失。脱细胞整体支架与分层支架相比天然组织,机械性能均有不同程度下降,提示结构(尤其超微结构)和成份的完整性对生物力学性能影响至关重要。第二部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC的相关体外研究目的:分离提取兔髌下脂肪垫间充质干细胞(IPFP-SC)并对之鉴定,检测骨软骨支架的生物相容性、细胞毒性,研究骨软骨基质成份、结构对IPFP-SC向成骨、成软骨分化的影响。初步探讨利用脱细胞基质进行生物3D打印。方法:利用胶原酶消化法和贴壁培养法分离提取出IPFP-SC,根据细胞表面分子流式细胞分析(FACS)、免疫荧光(IF)鉴定表型,检测其成骨、成软骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比较健康与OA兔IPFP-SC在增殖、迁移、成软骨方面的区别。利用直接接种法、直接植入法、浸提液培养法验证多种脱细胞骨软骨支架的生物相容性与细胞毒性。检测支架骨、软骨的仿生结构和骨、软骨组织成份对IPFP-SC向成骨、成软骨方向诱导的作用。利用Micro-CT扫描和天狼星染色连续切面图像数字化方式,获得兔天然骨软骨的结构数据,制作STL格式文件,对利用脱细胞基质生物3D打印进行初步探讨。结果:所提取细胞,FACS及IF验证表达CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成软骨、成脂分化。OA个体IPFP-SC相比健康个体,在增殖方面无显著差别,迁移及成软骨能力较弱。三种脱细胞支架生物相容性良好,无细胞毒性。骨软骨的结构、成份均可促进IPFP-SC向成骨、成软骨方向分化。得到的骨软骨结构STL文件可以较好的模拟打印出天然组织。结论:所提取细胞证实为间充质干细胞,OA个体IPFP-SC迁移及成软骨能力较弱可能是影响软骨修复的原因。脱细胞支架的仿生结构和组成成份均影响着IPFP-SC向成骨、成软骨分化,这为IPFP-SC体内诱导为目的细胞打下了基础第三部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC修复兔骨软骨缺损目的:通过将负载IPFP-SC的三种脱细胞骨软骨支架复合体植入兔股骨滑车骨软骨缺损模型中,研究三种组织工程方法修复骨软骨缺损的效果。方法:制作42例标准兔股骨滑车关节骨软骨缺损模型。分别将脱细胞关节整体骨软骨支架、脱细胞关节分层骨软骨支架、脱细胞肋分层骨软骨支架三种支架分为3组,组内分为负载或不负载IPFP-SC的亚组,除空白组共6小组,随机分配植入骨缺损模型中。术后1个月、3个月、6个月处死实验兔取得标本,大体观察修复组织的软骨面及软骨下骨面,石蜡切片进行HE、天狼猩红、番红固绿、甲苯胺蓝染色,比较各种组织工程方法修复骨软骨损伤的效果。结果:总体修复效果,负载IPFP-SC组优于单纯支架组,空白组最差,软骨修复方面,分层支架组优于整体支架组,软骨下骨修复方面则相反。1月时,除空白组外,各组间差异不大,3月、6月时,包括空白组,各组差异最明显。结论:三种组织工程构造方式对骨软骨缺损均能起到一定的修复作用,其中分层支架修复软骨能力较强,整体支架修复软骨下骨能力较强。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：

图 1-1：兔膝关节关节骨软骨整体取出术（A.兔膝关节内侧切口及划线示意图；B.切开皮肤及皮下；C.注意避开关节囊内侧血管及其分支；D.进入关节囊内；E.暴露股骨滑车部分；F.环钻钻取滑车中部骨软骨）

图 1-1：兔膝关节关节骨软骨整体取出术关节内侧切口及划线示意图；B.切开皮肤及皮下；C.注意避开关节囊内侧血管及其分D.进入关节囊内；E.暴露股骨滑车部分；F.环钻钻取滑车中部骨软骨）

图 1-3：兔关节骨软骨和肋骨软骨整体脱细胞流程图（2）关节和肋骨软骨三层微粒的脱细胞处理由于分层制作的组织颗粒对外形要求并不严格，将健康兔麻醉过量处死后，无菌取出兔股骨滑车、髁部关节骨软骨和 1~10 肋骨软骨，放入生理盐水备用。按以下处理流程（图 1-4）对兔关节和肋骨软骨进行三层结构微粒的脱细胞处理。①将切取的骨软骨去除附着的其他组织，去离子水反复冲洗 5 遍直至清亮。切削表面 HC，当切削时感觉从弹性及韧性慢慢变坚硬，观察切面颜色变黄，此为 CC，继续切削 CC，直至发现有血样组织，此时切削有磨砂感，此为 SB；切除肋骨骨皮质及骨膜、软骨膜，此时 HC 和 CC 轻轻震荡即可脱离，将肉眼可见的 CC 切下即可。将三层结构分别取下后，切碎至 2mm×2mm×2mm 大小。② 将组织微粒置于去离子水浸泡至完全淹没，放置于-80℃冷冻 8 h 后取出，放置于 37℃烘箱下完全融化后，再放置于超声清洗机内，超声功率 100%，温度 20℃，时间 20 min，超声清洗完毕后，再次以去离子水冲洗 3 遍直至液体清亮。以上步骤反复 3 次。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 徐铭恩;;生物3D打印——打印生命的希望[J];杭州科技;2013年05期

2 卓大宏;;世界卫生组织公布第二个“骨关节10年(2010~2020)”——促进肌骨关节健康,让人们可以恒动而不衰[J];中国矫形外科杂志;2011年16期

本文编号：2881613