载小分子药物Purmorphamine的丝素蛋白超细纤维的成骨诱导性能研究

发布时间：2017-04-10 12:18

  本文关键词：载小分子药物Purmorphamine的丝素蛋白超细纤维的成骨诱导性能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丝素蛋白(SF)是一种综合性能优良的天然生物材料,通过电纺技术将SF制备成超细纤维实现对天然细胞外基质(ECM)的超微结构仿生是当前骨组织工程(BTE)研究领域的热点之一。电纺SF纤维结合具有再生特性的干细胞将有利于提高BTE方法修复骨缺损的再生功效,这需要提高支架的成骨诱导分化性能。Purmorphamine(PM)是一种新型的嘌呤衍生类小分子药物,具有优良的骨生成诱导活性。本论文主要目的是基于电纺SF仿生纤维,探讨引入PM后SF基纤维的成骨诱导分化功效。为了检测SF本身是否具有成骨诱导能力,本研究首先采用Na2CO3脱胶法从蚕茧中提取SF以及全骨髓贴壁法从大鼠体内提取骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对提取的SF和BMSCs进行分析鉴定,然后配制含不同SF浓度(0.01%、0.05%和0.1%)的培养基并对BMSCs进行培养,体外检测这些SF溶液对BMSCs生长、增殖和成骨分化的影响。结果表明:1)蚕茧提取样品的FTIR光谱图在1653、1530.5和1212.3 cm-1附近出现较明显的吸收峰,分别为酰胺Ⅰ,酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ结构,由此可断定提取物质为SF。所提细胞对MSCs标志物CD29,CD44,CD90的阳性表达率分别为97.65%、99.01%和99.52%,对造血干细胞标志物cd45的表达率为0.07%,且该细胞具有三系分化潜能,因此断定所获取的细胞为bmscs;2)0.05%浓度的sf溶液不仅能显著促进bmscs粘附、铺展和增殖,还能够促进bmscs碱性磷酸酶(alp)的表达,诱导bmscs向成骨细胞分化。本部分工作说明sf自身具有成骨诱导特性且诱导功效与其作用浓度有关,sf可作为一种成骨诱导材料用于bte支架的构建。接着,基于天然骨(密质骨)骨胶纤维平行排列结构,本研究采用稳定射流电纺技术(sjes)将sf制备成高度取向(含少量聚氧化乙烯peo)的超细sf纤维,并用甲醇水溶液对取向sf纤维进行结构改性,之后作水浸泡处理以沥除纤维内的peo成分。结果发现:甲醇水溶液处理后,sf/peo纤维的力学性能得到明显提高,但经水处理沥除peo后,纤维力学性能有所降低,亲水性能则获得提高。经细胞相容性评估,发现甲醇改性后的纤维不仅具有良好的细胞相容性,还能调控细胞沿着纤维排列方向生长,并且沥除peo的sf取向纤维更有利于细胞的粘附和铺展。然后,对peo沥除后的sf纤维与传统电纺制备的无纺sf纤维的成骨诱导活性进行比较。结果发现:取向纤维虽然具有骨胶纤维的有序结构,能够促进bmscs的增殖,但却不利于bmscs的alp表达。sf纤维的无序结构更有利于促进bmscs的成骨分化。基于以上结果,本研究接着在无纺sf纤维中引入具优良生物相容性和骨传导与骨诱导活性的羟基磷灰石(hap)制备hap/sf复合纤维,从力学性能方面评价hap的最佳添加量,然后评估该体系下hap/sf复合纤维的成骨诱导性能。结果发现:1)hap能较好地分散在sf纤维中,并与sf的羧基基团存在一定的化学键相互作用。10%的hap能够显著提高sf纳米纤维的杨氏模量5.58倍,力学性能增强效果最佳,但亲水性能有所下降;2)10%hap的加入不仅能够提高bmscs的粘附、铺展和增殖以及细胞对材料的趋附性,还能够促进bmscs的alp和胶原(col)蛋白的分泌,提高alp,col,骨钙素(ocn)和骨粘连蛋白(on)的mrna表达水平,显示出优良的成骨分化诱导性能。最后,本研究引入pm以进一步增强hap/sf复合纤维的成骨诱导分化功效,从蛋白和基因水平检测pm/hap/sf复合纤维的成骨诱导活性并分析其作用机理。为了探索pm诱导bmscs成骨分化的最佳浓度,首先配制含不同pm浓度(0.1,3和10μm)的培养基对bmscs进行培养,并与常用成骨诱导剂体系(地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠)的成骨诱导活性进行比较。结果发现3μmpm的成骨诱导效果最佳,诱导功效与常用成骨诱导剂相当,说明pm可以很好的取代常用成骨诱导剂,用于bte支架的制备。然后,基于这一最佳浓度,对纤维中引入pm的最佳负载量进行探索,并检测不同pm浓度对纤维物理性能(如形貌、力学性能和亲水性能等)、pm药物释放行为及细胞相容性的影响。结果发现:1)pm的加入虽然有利于细化纤维直径,但也会略微降低纤维力学性能和亲水性能;2)纤维内的hap组分对pm药物释放具有缓释作用;3)pm的加入有利于促进细胞的粘附、铺展和增殖。最后,从蛋白和基因水平上评价细胞相容性有显著性差异的两个载药纤维组别(10-PM/HAp/SF和20-PM/HAp/SF)诱导BMSCs成骨分化的效能,并探索其诱导细胞成骨分化的作用机理,结果发现:1)PM与HAp诱导BMSCs成骨分化效果具有协同作用,共同促进细胞ALP,COL,OCN和ON基因的表达;2)10-PM/HAp/SF复合纤维主要通过激活Hedgehog信号通路来诱导BMSCs的成骨分化。总之,本研究证实了SF自身就具有成骨诱导活性这一本质特性,通过SJES制备了取向SF纤维对天然骨(密质骨)进行结构仿生,发现其成骨诱导活性并不如无纺SF纤维。在无纺SF纤维中引入HAp,发现10%HAp/SF复合纤维的力学性能和成骨诱导活性都有显著的提高。PM诱导BMSCs成骨分化的最佳作用浓度是3μM,引入PM的PM/HAp/SF复合纤维可显著提高对BMSCs的成骨诱导作用功效,且其可能主要是通过激活Hedgehog信号通路诱导BMSCs的成骨分化。所有结果均表明PM/HAp/SF纤维可显著诱导BMSCs成骨分化,具有优良的生物相容性和成骨诱导活性,这为今后基于PM/HAp/SF纤维开展对体内骨缺损的再生性修复评价工作奠定了基础,在BTE领域应用前景诱人。
【关键词】：骨组织工程 丝素蛋白 电纺丝 Purmorphamine 成骨分化
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;TQ340.64
【目录】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 第一章 绪论15-34
• 1.1 骨组织工程15-22
• 1.1.1 干细胞16-19
• 1.1.2 骨支架材料19-21
• 1.1.3 干细胞成骨分化的诱导方法21-22
• 1.2 丝素蛋白22-26
• 1.2.1 丝素蛋白概述22-24
• 1.2.2 丝素蛋白在生物医学领域的应用24-25
• 1.2.3 丝素蛋白在骨组织工程中的应用25-26
• 1.3 促进骨修复的小分子药物26-30
• 1.3.1 小分子药物26
• 1.3.2 小分子药物在骨组织工程中的应用26-29
• 1.3.3 Purmorphamine简介及研究现状29-30
• 1.4 本课题的提出、研究内容及创新性30-34
• 1.4.1 课题提出30-32
• 1.4.2 课题研究内容32-33
• 1.4.3 课题创新性33-34
• 第二章 SF的提取及SF溶液成骨分化性能的研究34-46
• 2.1 引言34-35
• 2.2 实验部分35-39
• 2.2.1 实验材料与仪器35-36
• 2.2.2 SF的提取36-37
• 2.2.3 SF的形貌观察和鉴定37
• 2.2.4 BMSCs的提取及培养37-38
• 2.2.5 SF溶液对BMSCs增殖的影响38
• 2.2.6 SF溶液对BMSCs体外成骨分化性能的影响38-39
• 2.2.7 统计学分析39
• 2.3 结果与讨论39-45
• 2.3.1 SF的提取及表征39
• 2.3.2 BMSCs的提取、培养及鉴定39-41
• 2.3.3 SF溶液对BMSCs粘附及增殖能力的影响41-43
• 2.3.4 SF溶液诱导BMSCs的成骨分化性能43-45
• 2.4 本章小结45-46
• 第三章 取向超细SF纤维的制备及成骨分化性能46-66
• 3.1 引言46
• 3.2 实验部分46-52
• 3.2.1 实验材料与仪器46-47
• 3.2.2 纺丝液的配制47-48
• 3.2.3 稳定射流电纺丝48
• 3.2.4 超细取向SF纤维的改性及表征48-50
• 3.2.5 iPSC-MSCs的诱导培养50-51
• 3.2.6 支架材料的预处理51
• 3.2.7 取向SF纤维体外细胞相容性评价51-52
• 3.2.8 取向SF纤维的体外诱导BMSCs成骨分化性能52
• 3.2.9 统计学分析52
• 3.3 结果与讨论52-65
• 3.3.1 超细取向SF纤维的制备52-55
• 3.3.2 取向SF/PEO纤维的改性及表征55-60
• 3.3.3 iPSC-MSCs的诱导及培养60-61
• 3.3.4 取向SF纤维对iPSC-MSCs细胞行为的影响61-64
• 3.3.5 取向SF纤维诱导BMSCs的成骨分化性能64-65
• 3.4 本章小结65-66
• 第四章 HAp/SF纳米纤维的制备及成骨性能66-83
• 4.1 引言66
• 4.2 实验部分66-71
• 4.2.1 实验材料与仪器66-67
• 4.2.2 HAp/SF纳米纤维的制备67
• 4.2.3 HAp/SF纳米纤维的表征67-68
• 4.2.4 HAp/SF纳米纤维体外细胞相容性68-69
• 4.2.5 HAp/SF纳米纤维体外诱导BMSCs成骨分化69-71
• 4.2.6 统计学分析71
• 4.3 结果与讨论71-81
• 4.3.1 HAp/SF纳米纤维的制备与表征71-75
• 4.3.2 HAp/SF纳米纤维对BMSCs生长行为的影响75-78
• 4.3.3 HAp/SF纳米纤维诱导BMSCs的成骨分化性能78-81
• 4.4 本章小结81-83
• 第五章 载PM的HAp/SF纤维的制备及成骨性能83-105
• 5.1 引言83-84
• 5.2 实验部分84-89
• 5.2.1 实验材料与仪器84
• 5.2.2 PM诱导BMSCs成骨分化性能的检测84-86
• 5.2.3 PM/HAp/SF纳米纤维的制备86
• 5.2.4 PM/HAp/SF纳米纤维的表征86-87
• 5.2.5 PM/HAp/SF纳米纤维的体外细胞相容性87-88
• 5.2.6 PM/HAp/SF纳米纤维体外诱导BMSCs的成骨分化性能88
• 5.2.7 PM/HAp/SF纳米纤维诱导BMSCs成骨分化信号通路的研究88-89
• 5.2.8 统计学分析89
• 5.3 结果与讨论89-103
• 5.3.1 PM对BMSCs成骨分化性能的影响89-92
• 5.3.2 PM/HAp/SF纳米纤维的制备及表征92-97
• 5.3.3 PM/HAp/SF纳米纤维对BMSCs细胞行为的影响97-100
• 5.3.4 PM/HAp/SF纳米纤维体外诱导BMSCs的成骨分化性能100-102
• 5.3.5 PM/HAp/SF纳米纤维诱导BMSCs成骨分化信号通路的检测102-103
• 5.4 本章小结103-105
• 第六章 结论和展望105-108
• 6.1 本文主要结论105-106
• 6.2 展望106-108
• 参考文献108-120
• 攻读硕士期间科研与获奖情况120-122
• 致谢122-123

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