壳聚糖/海藻酸钠膜支架—骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的研究
发布时间：2021-01-11 22:47
研究一 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定目的:探讨Beagle犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外分离、培养条件以及生物学特性的相关鉴定。方法:Beagle犬使用戊巴比妥钠麻醉（30mg/Kg）成功后,浓度8%的硫化钠液脱毛、温清水擦拭、碘伏液消毒后铺无菌巾单,无菌操作下,选用16号骨髓穿刺针,分别自左右两侧髂嵴抽取Beagle犬骨髓血,注入含肝素和DMEM/F12的离心管内,采用全骨髓血联合贴壁法培养Beagle犬骨髓间充质干细胞:骨髓血以1500转/分,离心5分钟,弃上清,加入DMEM/F12适量。再以1200转/分,离心5分钟,弃上清液,计数,调整细胞密度为5×10-1mL,加入完全培养基中(培养基主要成分包括:DMEM\F12培养液（HYCLONE公司,USA）、10%的胎牛血清（HYCLONE公司,USA）、青链霉素混合液（Solarbio公司,pH=7.2）,制成细胞悬液,吹打混匀后接种于25cm2培养瓶内,置于37℃,含5%C02培养箱中常规培养。48小时后首次给予全量换液,以后每48小时至72小时、培养基变黄时换液1次。当细胞融合至80%,采用0....
【文章来源】：广州中医药大学广东省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文献研究
1.1 目前软骨缺损的修复技术
1.1.1 微骨折技术
1.1.2 自体软骨细胞移植技术
1.1.3 膜支架技术
1.2 未来软骨再生方法的研究
1.2.1 体外软骨细胞-支架材料复合体
1.2.2 细胞及组织的替代物
1.2.2.1 骨髓间充质干细胞
1.2.2.2 其他来源的干细胞
1.2.2.3 自体外周血干细胞
1.2.2.4 诱导多能干细胞
1.2.2.5 同种异体移植物
1.2.2.6 创新型无细胞的生物材料
1.2.2.7 自体诱导软骨形成术
1.2.3 无支架方式的研究
1.3 结论
第二章 种子细胞的研究 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定
2.1 前言
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 主要仪器
2.2.3 主要试剂
2.2.4 本部分实验所需培养液、缓冲液及工作液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离及原代培养
2.3.2 Beagle犬骨髓间充质干细胞的传代培养
2.3.3 Beagle犬骨髓间充质干细胞的形态学观察及鉴定
2.3.3.1 倒置显微镜观察
2.3.3.2 免疫荧光化学染色
2.3.3.3 骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色
2.3.3.4 骨髓间充质干细胞钙结节染色
2.3.3.5 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物的表达
2.3.4 CCK-8检测细胞增殖
2.4 实验数据的整理与统计分析
2.5 结果
2.5.1 倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态学观察结果
2.5.2 骨髓间充质干细胞透射电镜观察结果
2.5.3 骨髓间充质干细胞苏木精-伊红染色鉴定结果
2.5.4 骨髓间充质干细胞免疫荧光鉴定结果
2.5.5 骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色结果
2.5.6 骨髓间充质干细胞的钙结节染色结果
2.5.7 骨髓间充质干细胞表面标记物流式细胞仪检测的结果
2.5.8 CCK-8检测细胞增殖结果
2.6 讨论
第三章 中药支架材料的研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髄间充质干细胞复合体的体外实验研究
3.1 前言
3.2 实验材料
3.2.1 实验器材
3.2.2 主要试剂
3.3 实验方法
3.3.1 壳聚糖的制备
3.3.2 海藻酸钠的制备
3.3.3 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的制备
3.3.4 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架形态观察
3.3.5 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞共培养
3.3.6 扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）观察中药提取物支架材料上细胞生长情况
3.3.6.1 扫描电镜观察实验
3.3.6.2 透射电镜观察实验
3.4 结果
3.4.1 壳聚糖、海藻酸钠制备以及制备完成的中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架大体形态观察结果
3.4.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料形貌观察结果
3.4.3 倒置显微镜、扫描电镜（SEM）观察支架材料上细胞生长情况结果
3.4.3.1 倒置显微镜观察支架材料上细胞生长情况结果
3.4.3.2 扫描电镜（SEM）观察中药提取物支架材料上细胞生长情况结果
3.5 讨论
第四章 动物实验研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体修复Beagle犬股骨头软骨缺损的动物实验研究
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 实验器材
4.2.2 主要试剂
4.3 实验方法
4.3.1 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的准备及预处理
4.3.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体的构建
4.3.3 Beagle犬股骨头软骨缺损模型的建立
4.3.4 观察指标的选择
4.3.4.1 实验动物的一般情况
4.3.4.2 修复软骨缺损的股骨头大体形态检测
4.3.4.3 标本组织学检查
4.3.4.3.1 苏木精-伊红染色（HE染色）方法
4.3.4.3.2 软骨染色液（甲苯胺蓝法）染色方法
4.3.4.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（SABC法）方法
4.3.4.3.4 透射电镜观察实验方法
4.4 实验数据的整理与统计分析
4.5 结果
4.5.1 一般观察结果
4.5.2 Beagle犬股骨头标本大体形态学观察结果
4.5.3 Beagle犬股骨头软骨缺损修复标本的组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察结果
4.5.4 Beagle犬股骨头修复软骨缺损区域标本透射电镜观察结果
4.6 讨论
4.6.1 种子细胞
4.6.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架作为细胞支架的优势及其作用.
4.6.3 中药提取物膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体修复软骨缺损疗效的分析
4.6.4 动物模型的建立
4.6.5 实验的局限性
结语
参考文献
附录
在校期间发表论文情况
致谢
统计学审核证明
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于中医药文化推广的实践路径研究——以贵阳中医学院为例[J]. 王羿,武静,王玉,石江梅. 贵阳中医学院学报. 2018(05)
[2]Efficacy of chitosan and sodium alginate scaffolds for repair of spinal cord injury in rats[J]. Zi-ang Yao,Feng-jia Chen,Hong-li Cui,Tong Lin,Na Guo,Hai-ge Wu. Neural Regeneration Research. 2018(03)
[3]Mesenchymal stem cells for cartilage regeneration in osteoarthritis[J]. Baldur Kristjánsson,Sittisak Honsawek. World Journal of Orthopedics. 2017(09)
[4]自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究[J]. 杨程,倪江东,张寿,范忠诚. 中南大学学报(医学版). 2017(08)
[5]Systematic review on the use of autologous matrix-induced chondrogenesis for the repair of articular cartilage defects in patients[J]. Nafisa Shaikh,Matthew K T Seah,Wasim S Khan. World Journal of Orthopedics. 2017(07)
[6]基于组织工程研究的可降解支架材料选择策略[J]. 高庆东,祝旭龙,向俊西,吕毅,李建辉. 生物工程学报. 2016(02)
[7]应用超顺磁性氧化铁粒子标记组织工程关节软骨种子细胞及在体磁共振示踪的研究[J]. 金旭红,杨柳,段小军,谢兵,李忠,谭洪波. 中华医学杂志. 2007(45)
本文编号：2971619
【文章来源】：广州中医药大学广东省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文献研究
1.1 目前软骨缺损的修复技术
1.1.1 微骨折技术
1.1.2 自体软骨细胞移植技术
1.1.3 膜支架技术
1.2 未来软骨再生方法的研究
1.2.1 体外软骨细胞-支架材料复合体
1.2.2 细胞及组织的替代物
1.2.2.1 骨髓间充质干细胞
1.2.2.2 其他来源的干细胞
1.2.2.3 自体外周血干细胞
1.2.2.4 诱导多能干细胞
1.2.2.5 同种异体移植物
1.2.2.6 创新型无细胞的生物材料
1.2.2.7 自体诱导软骨形成术
1.2.3 无支架方式的研究
1.3 结论
第二章 种子细胞的研究 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定
2.1 前言
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 主要仪器
2.2.3 主要试剂
2.2.4 本部分实验所需培养液、缓冲液及工作液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离及原代培养
2.3.2 Beagle犬骨髓间充质干细胞的传代培养
2.3.3 Beagle犬骨髓间充质干细胞的形态学观察及鉴定
2.3.3.1 倒置显微镜观察
2.3.3.2 免疫荧光化学染色
2.3.3.3 骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色
2.3.3.4 骨髓间充质干细胞钙结节染色
2.3.3.5 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物的表达
2.3.4 CCK-8检测细胞增殖
2.4 实验数据的整理与统计分析
2.5 结果
2.5.1 倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态学观察结果
2.5.2 骨髓间充质干细胞透射电镜观察结果
2.5.3 骨髓间充质干细胞苏木精-伊红染色鉴定结果
2.5.4 骨髓间充质干细胞免疫荧光鉴定结果
2.5.5 骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色结果
2.5.6 骨髓间充质干细胞的钙结节染色结果
2.5.7 骨髓间充质干细胞表面标记物流式细胞仪检测的结果
2.5.8 CCK-8检测细胞增殖结果
2.6 讨论
第三章 中药支架材料的研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髄间充质干细胞复合体的体外实验研究
3.1 前言
3.2 实验材料
3.2.1 实验器材
3.2.2 主要试剂
3.3 实验方法
3.3.1 壳聚糖的制备
3.3.2 海藻酸钠的制备
3.3.3 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的制备
3.3.4 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架形态观察
3.3.5 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞共培养
3.3.6 扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）观察中药提取物支架材料上细胞生长情况
3.3.6.1 扫描电镜观察实验
3.3.6.2 透射电镜观察实验
3.4 结果
3.4.1 壳聚糖、海藻酸钠制备以及制备完成的中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架大体形态观察结果
3.4.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料形貌观察结果
3.4.3 倒置显微镜、扫描电镜（SEM）观察支架材料上细胞生长情况结果
3.4.3.1 倒置显微镜观察支架材料上细胞生长情况结果
3.4.3.2 扫描电镜（SEM）观察中药提取物支架材料上细胞生长情况结果
3.5 讨论
第四章 动物实验研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体修复Beagle犬股骨头软骨缺损的动物实验研究
4.1 前言
4.2 实验材料
4.2.1 实验器材
4.2.2 主要试剂
4.3 实验方法
4.3.1 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的准备及预处理
4.3.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体的构建
4.3.3 Beagle犬股骨头软骨缺损模型的建立
4.3.4 观察指标的选择
4.3.4.1 实验动物的一般情况
4.3.4.2 修复软骨缺损的股骨头大体形态检测
4.3.4.3 标本组织学检查
4.3.4.3.1 苏木精-伊红染色（HE染色）方法
4.3.4.3.2 软骨染色液（甲苯胺蓝法）染色方法
4.3.4.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（SABC法）方法
4.3.4.3.4 透射电镜观察实验方法
4.4 实验数据的整理与统计分析
4.5 结果
4.5.1 一般观察结果
4.5.2 Beagle犬股骨头标本大体形态学观察结果
4.5.3 Beagle犬股骨头软骨缺损修复标本的组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察结果
4.5.4 Beagle犬股骨头修复软骨缺损区域标本透射电镜观察结果
4.6 讨论
4.6.1 种子细胞
4.6.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架作为细胞支架的优势及其作用.
4.6.3 中药提取物膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体修复软骨缺损疗效的分析
4.6.4 动物模型的建立
4.6.5 实验的局限性
结语
参考文献
附录
在校期间发表论文情况
致谢
统计学审核证明
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于中医药文化推广的实践路径研究——以贵阳中医学院为例[J]. 王羿,武静,王玉,石江梅. 贵阳中医学院学报. 2018(05)
[2]Efficacy of chitosan and sodium alginate scaffolds for repair of spinal cord injury in rats[J]. Zi-ang Yao,Feng-jia Chen,Hong-li Cui,Tong Lin,Na Guo,Hai-ge Wu. Neural Regeneration Research. 2018(03)
[3]Mesenchymal stem cells for cartilage regeneration in osteoarthritis[J]. Baldur Kristjánsson,Sittisak Honsawek. World Journal of Orthopedics. 2017(09)
[4]自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究[J]. 杨程,倪江东,张寿,范忠诚. 中南大学学报(医学版). 2017(08)
[5]Systematic review on the use of autologous matrix-induced chondrogenesis for the repair of articular cartilage defects in patients[J]. Nafisa Shaikh,Matthew K T Seah,Wasim S Khan. World Journal of Orthopedics. 2017(07)
[6]基于组织工程研究的可降解支架材料选择策略[J]. 高庆东,祝旭龙,向俊西,吕毅,李建辉. 生物工程学报. 2016(02)
[7]应用超顺磁性氧化铁粒子标记组织工程关节软骨种子细胞及在体磁共振示踪的研究[J]. 金旭红,杨柳,段小军,谢兵,李忠,谭洪波. 中华医学杂志. 2007(45)
本文编号：2971619
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/swyx/2971619.html
