光动力疗法对MRSA及其生物被膜作用的体外实验研究

发布时间：2017-04-11 11:13

  本文关键词：光动力疗法对MRSA及其生物被膜作用的体外实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究新型光敏剂亚苄基环戊酮化合物(P2)介导的光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及其生物被膜的体外作用。方法(1)将3株MRSA临床菌株配制成浓度为2× 108CFU/ml的细菌悬液,与浓度为5、10、20、50μM的光敏剂P2溶液等体积混匀,孵育30 min,用波长为532 nm、功率密度40 mW/cm2的连续激光照射10 min,能量密度为24 J/cm2。并设空白对照组、单纯光敏剂组及单纯光照组。每组3个样本,重复3次。处理后即刻采用稀释平板法进行菌落计数,评价P2-PDT对MRSA浮游菌的体外杀伤效果。(2)培养MRSAO生物被膜,按方法(1)进行P2-PDT处理(P2浓度为10 gM)。处理后,采用SYTO9(标记活细菌,显示绿色荧光)、PI(标记死细菌,显示红色荧光)荧光探针标记膜内细菌,通过激光共聚焦显微镜观察生物被膜内细菌的死亡情况。培养MRSAO生物被膜,按方法(1)进行P2-PDT处理(P2浓度为10、25μM),并设空白对照组、单纯光敏剂组及单纯光照组。每组6个样本,重复3次。处理后,采用XTT法检测生物被膜内细菌的存活率。(3)培养MRSAO生物被膜,按方法(1)进行P2-PDT处理(P2浓度为10、25μM)。采用结晶紫染色法光镜下观察生物被膜致密度、菌落形态以及网状结构的变化,并用酶标仪定量检测生物被膜的破坏程度。采用FITC-Cona(产生绿色荧光)荧光探针标记被膜中的多糖,通过激光共聚焦显微镜观察多糖的变化。在微孔滤膜管内培养MRSAO生物被膜,按方法(1)对其进行P2-PDT处理(P2浓度为10μM),处理后加入10μg/ml左氧氟沙星(Levofloxacin, LVFX)溶液400μ1,孵育6小时后采用高压液相色谱仪检测透过生物被膜的LVFX的浓度。并设空白对照组。每组6个样本。(4) P2-PDT与LVFX联合杀伤生物被膜内细菌在96孔板中进行,按方法(1)对MRSAO生物被膜进行P2-PDT处理后(P2浓度为10μM),分别加入浓度为10μg/ml与20μg/ml的LVFX溶液,24 h后XTT法检测生物被膜内细菌的存活率。并设空白对照组、单纯LVFX组及单纯PDT组。每组6个样本。比较各组细菌存活率。结果(1) P2-PDT对3株MRSA临床菌株均有不同程度的杀伤作用。当光敏剂P2浓度为5μM时,3株MRSA临床菌株的菌落数均下降3 log1o以上,达到有效杀伤；P2浓度为10μM时,达到最大杀伤。(2)激光共聚焦显微镜观察到,经P2-PDT处理的生物被膜内绿色荧光的平均强度(299.84 a.u. ± 53.39 a.u.)明显弱于对照组(485.44 a.u. ± 120.21 a.u.) (P 0.01),在绿色荧光与红色荧光的混合图像中,绿色荧光所占比例(31.87%±6.25%)明显低于空白对照组(61.67%±11.07%)(P0.01),表明生物被膜内细菌死亡数量增加。XTT结果显示,PDT后生物被膜内细菌存活率明显下降,P2浓度25μM组的杀菌作用强于10 μM组(P0.05),25μM组细菌存活率为6.25%±1.7%,10 μM组细菌存活率为15.77%±3.5%。(3)光镜下可见PDT后生物被膜致密度降低,菌落变得稀疏,呈点状分布,菌落间网状结构消失,光敏剂浓度25 μM组破坏程度强于10μM组。定量分析发现,PDT组的OD值低于空白对照组,且P2浓度25 μM组的OD值(1.046±0.157)明显低于10μM浓度组(1.283±0.280)(P0.01)。激光共聚焦显微镜观察到,经P2-PDT处理的生物被膜内的绿色荧光强度(183.41 a.u.± 0.31 a.u.)明显弱于空白对照组(474.57 a.u.± 117.26 a.u.)(P0.01),表明生物被膜内多糖减少。经P2-PDT处理后,生物被膜对LVFX的渗透性增强,即PDT组LVFX浓度为2.016± 0.348μg/ml,空白对照组为1.602±0.474μg/ml (P 0.01).(4) P2-PDT与LVFX联合应用对生物被膜内细菌的杀伤作用。四组生物被膜内细菌的存活率分别为：A组为(100.00±0)%、B组(86.49±3.5)%、C组(57.42±0.9)%、D组(0.76±0.6)%,其中D组生物被膜内细菌的存活率显著低于B组和C组,三组比较差异有非常显著意义(P0.01)。结论：1. P2-PDT在体外能够有效杀伤MRSA临床菌株的浮游菌。2. P2-PDT在体外能够杀伤MRSAO生物被膜内的细菌,但达到相同杀伤效果所需P2浓度较浮游菌高。3. P2-PDT可以破坏生物被膜的结构,并且可能通过破坏生物被膜而增强其对抗生素(左氧氟沙星)的渗透性。4. P2-PDT与左氧氟沙星联合应用对杀伤生物被膜内细菌有协同作用。
【关键词】：光动力疗法 亚苄基环戊酮 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 生物被膜 左氧氟沙星
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R454.2
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-19
• 第一部分：P2-PDT对MRSA浮游菌的体外杀伤作用19-24
• 引言19
• 一. 材料与方法19-21
• 二. 实验结果21-22
• 三. 讨论22-23
• 四. 小结23-24
• 第二部分：P2-PDT对MRSA0生物被膜内细菌的体外杀伤作用24-31
• 引言24
• 一. 材料与方法24-26
• 二. 实验结果26-28
• 三. 讨论28-30
• 四. 小结30-31
• 第三部分：P2-PDT对生物被膜结构的破坏作用31-41
• 引言31
• 一. 材料与方法31-35
• 二. 结果35-38
• 三. 讨论38-40
• 四. 小结40-41
• 第四部分：P2-PDT与抗生素联合应用对生物被膜内细菌的杀伤效应41-45
• 引言41
• 一. 材料与方法41-42
• 二. 实验结果42-43
• 三. 讨论43-44
• 四. 小结44-45
• 总结与展望45-46
• 参考文献46-53
• 文献综述53-64
• 参考文献60-64
• 攻读学位期间发表文章情况64-65
• 致谢65

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  本文关键词：光动力疗法对MRSA及其生物被膜作用的体外实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：298974