BMP2和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

发布时间：2017-04-23 13:05

  本文关键词：BMP2和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的1.本实验为建立一套行之有效的体外培养兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。2.通过腺病毒介导人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)和EGFP基因转染兔BMSCs后，通过行Westenblot及免疫细胞化学染色以观察BMP2和EGFP的表达情况。方法1.用骨穿针抽取兔股骨粗隆处的骨髓，通过密度梯度离心联合贴壁法，分离、培养兔BMSCs并观察细胞生长情况。2.使用成骨诱导培养基(含地塞米松10-8mol/L、维生素C50mg/L、β-磷酸甘油10mmol/L、体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养液)，在诱导后第7天、14天分别检测Ⅰ型胶原及碱性磷酸酶（ALP），成骨诱导后第3周行钙结节检测；流式细胞仪检测细胞周期和表面标记。3.转染后，通过免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测外源基因的表达。结果1.分离出大量具有活性的兔BMSCs。接种48小时后观察，细胞贴壁形态均表现为长梭形，呈涡旋状、放射状排列。一般4～5d左右可长满培养瓶底壁。2.兔BMSCs细胞周期约有56.84%处于G1期；CD44表达阳性，CD45表达阴性；经成骨细胞诱导后，Ⅰ型胶原免疫组化染色显示诱导组细胞胞质呈阳性表达表现为棕黄色，正常组胞质阴性表达。ALP酶标法显示诱导组呈阳性表达，其含量较正常组明显增加。实验组诱导组茜素红染色呈阳性，正常组未染色。3.转染48h后，通过免疫组化检测结果示兔BMSCs细胞胞浆可见棕黄色染色，呈阳性表达，而未转染细胞呈阴性。分别提取转染48h后及未转染的细胞蛋白，Western-blot检测到Ad-BMP2/EGFP组有阳性条带，而Ad-EGFP组及未转染组的条带较弱。说明Ad-BMP-2/EGFP转染兔BMSCs后BMP2目的蛋白在细胞内有高表达。结论1.通过密度梯度离心联合贴壁培养法可以获得纯化的兔骨髓间充质干细胞。2.通过将转染目的基因的骨髓基质干细胞行免疫组化、Westenblot实验证实转染后细胞可高效表达BMP-2并促进其增殖分化。
【关键词】：骨形态发生蛋白-2 腺病毒 骨髓间充质干细胞 基因转染
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英汉缩略词对照表8-10
• 前言10-13
• 1 材料和方法13-27
• 1.1 材料与仪器13-17
• 1.2 实验方法17-27
• 2 结果27-36
• 2.1 兔 BMSCs 的形态观察27
• 2.2 兔 BMSCs 生长曲线27-28
• 2.3 组织学染色28-29
• 2.4 兔骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定29
• 2.5 兔 BMSCs 向成骨细胞方向分化29-32
• 2.6 流式细胞仪测兔骨髓间充质细胞周期32-33
• 2.7 感染 Ad-BMP-2/EGFP 后兔 BMSCs 中绿色荧光蛋白的表达33-34
• 2.8 免疫组化检测 BMP-2 的表达34-35
• 2.9 Westen blot 检测分泌 BMP-2 蛋白表达35-36
• 3 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-56
• 参考文献51-56
• 攻读学位期间发表的学术论文目录56-57
• 致谢57-58

【参考文献】

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本文编号：322422