携带定点固载标签的人PTH表达纯化及其纳米抗体的淘选

发布时间：2017-04-27 16:15

  本文关键词：携带定点固载标签的人PTH表达纯化及其纳米抗体的淘选，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人体内过多的甲状旁腺激素(PTH)会造成继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)从而引发多系统病变,加重肾衰患者病情。目前,临床上降低PTH的方法有药物、手术、血液净化三种治疗方式。前两者副作用很大,间接加重肾脏的负担,而目前存在的血液净化方法对PTH的去除能力差,费用高,因此开发特异性的高亲和性吸附材料十分必要。纳米抗体具有独特的优势,是配基材料的最佳选择。目前利用噬菌体展示库筛选抗体的方法比较成熟,但是传统方法中利用疏水作用固载抗原筛选抗体会使蛋白二维结构发生变化,因此并不适用于亲水性的小分子蛋白类抗原。本研究将定点固载技术引入抗体筛选过程,可以保持抗原的天然构象。本论文尝试了两种用于定点固载的标签,经过比较,采用后者成功筛选出了抗人PTH的纳米抗体。研究内容如下： (1)带醛基的PTH的制备。利用合成的方法获得了甲酰甘氨酸生成酶(FGE)及带醛基标签前体的PTH的基因,并构建了一系列载体,尝试了体外催化和体内共表达催化两种醛基生成的策略,最后利用不相容质粒的共表达体系得到了带有醛基标签的目的蛋白,但带醛基的蛋白产量低,尚需深入研究。 (2)带巯基的PTH的制备。利用PCR技术在PTH的碳末端外加一个半胱氨酸,构建载体pET23a-PTH-C,在肠杆菌中实现了可溶表达,表达量在25%-30%之间,经过粗分离和阳离子交换层析,得到了纯度95%以上的终产品,利用Ellman试剂定性检测,证实了存在自由巯基。 (3)定点固载抗原法筛选纳米抗体。依据研究结果,利用巯基标签固载抗原,从非免疫纳米抗体库中筛选纳米抗体。比较了传统包被抗原法和定点包被抗原法,分别得到3种和13种纳米抗体序列,而且前面3种全部包含在后面13种中,说明定点固载更有利于特异性抗体的富集。同时比较了定点包被时pH为8.0和7.0的情况,分别得到了4种和13种纳米抗体,前者有3种包含于后者中,因此最佳固载pH为7.0。通过两组比较,最终获得了14种不同的纳米抗体,经噬菌体ELISA检测,有11种具有良好的结合活性。
【关键词】：甲状旁腺激素 醛基标签 巯基标签 纳米抗体的筛选 定点固载
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 1 文献综述12-28
• 1.1 甲状旁腺激素的致病机理及其导致的病症的治疗12-15
• 1.1.1 甲状旁腺激素概述12-13
• 1.1.2 慢性肾衰竭及甲状旁腺激素的致病机理13-14
• 1.1.3 降低肾衰竭病人体内过多甲状旁腺激素的方法14-15
• 1.2 纳米抗体技术15-21
• 1.2.1 纳米抗体的发现及结构特征15-17
• 1.2.2 纳米抗体的理化生性质及其应用17-19
• 1.2.3 噬菌体展示库简介19-20
• 1.2.4 纳米抗体的筛选20-21
• 1.3 蛋白修饰技术21-27
• 1.3.1 蛋白修饰的目的21
• 1.3.2 蛋白的修饰方法21-26
• 1.3.3 醛基标签26-27
• 1.3.4 巯基标签27
• 1.4 本论文的研究目的、内容及意义27-28
• 2 带醛基标签的甲状旁腺激素的制备28-46
• 2.1 引言28
• 2.2 实验材料28-30
• 2.2.1 材料及试剂28-29
• 2.2.2 主要仪器及耗材29-30
• 2.3 实验方法30-35
• 2.3.1 FGE及ald_(13)-PTH基因的合成30-31
• 2.3.2 重组质粒pET23a-ald_(13)-PTH的构建、筛选及表达31-32
• 2.3.3 重组蛋白ald_(13)-PTH的可溶性考察32
• 2.3.4 重组蛋白ald_(13)-PTH表达条件优化32-33
• 2.3.5 化学合成的FGE相关质粒的构建、筛选及表达33
• 2.3.6 重组质粒pET28a-ald_(13)-PTH的构建、筛选及表达33
• 2.3.7 改变重组质粒pET23a-ald_(13)-PTH的抗性33-34
• 2.3.8 共表达体系的建立34-35
• 2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳35
• 2.3.10 琼脂糖凝胶电泳35
• 2.4 实验结果及讨论35-45
• 2.4.1 重组质粒pET23a-ald_(13)-PTH的构建、筛选及表达35-37
• 2.4.2 重组蛋白ald_(13)-PTH的可溶性考察37
• 2.4.3 重组蛋白ald_(13)-PTH表达条件优化37-41
• 2.4.4 化学合成的FGE相关质粒的构建、筛选及表达41-42
• 2.4.5 不相容质粒共表达体系的建立42-45
• 2.5 小结45-46
• 3 带巯基标签的甲状旁腺激素的制备46-55
• 3.1 引言46
• 3.2 实验材料46-47
• 3.2.1 材料及试剂46-47
• 3.2.2 主要仪器及耗材47
• 3.3 实验方法47-51
• 3.3.1 PTH-C基因的获得及载体构建47-48
• 3.3.2 PTH-C蛋白的表达48
• 3.3.3 蛋白的可溶性考察48
• 3.3.4 蛋白预处理——初步纯化48-49
• 3.3.5 SP强阳离子交换层析——精分离49-50
• 3.3.6 测定目的蛋白的纯度及浓度50-51
• 3.4 实验结果及讨论51-54
• 3.4.1 PTH-C蛋白的表达51
• 3.4.2 蛋白的可溶性考察51-52
• 3.4.3 蛋白的分离纯化52-54
• 3.5 小结54-55
• 4 抗人PTH纳米抗体的筛选55-75
• 4.1 引言55
• 4.2 实验材料55-57
• 4.2.1 材料及试剂55-56
• 4.2.2 主要仪器及耗材56-57
• 4.3 实验方法57-63
• 4.3.1 纳米抗体库的建立57
• 4.3.2 噬菌体的液体扩增57
• 4.3.3 噬菌体滴度的测定57-58
• 4.3.4 纳米抗体的筛选58-59
• 4.3.5 序列分析59-60
• 4.3.6 ELISA鉴定单克隆噬菌体活性60-61
• 4.3.7 亲和常数的估算61-63
• 4.4 实验结果及讨论63-74
• 4.4.1 纳米抗体的筛选63-64
• 4.4.2 测序分析64-69
• 4.4.3 ELISA鉴定单克隆噬菌体活性69-71
• 4.4.4 亲和常数的估算71-74
• 4.5 小结74-75
• 结论75-76
• 展望76-77
• 参考文献77-82
• 附录A FGE基因序列82-84
• 附录B ald_(13)-PTH基因序列及蛋白序列84-85
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况85-86
• 致谢86-87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：330966