金纳米颗粒标记呼吸道合胞病毒入侵细胞的实时暗场光散射成像分析

发布时间：2017-04-29 05:00

  本文关键词：金纳米颗粒标记呼吸道合胞病毒入侵细胞的实时暗场光散射成像分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：病毒,尤其是传染性病毒,对人类身体健康具有很大危害。因此,了解和阐明病毒入侵宿主细胞的过程和机制对预防和治疗病毒性疾病十分重要。目前,研究病毒入侵细胞过程常采用单个病毒视踪技术,即通过观察单个病毒入侵宿主细胞的实时动态过程来阐释病毒入侵宿主细胞的机制。近年来,为成功示踪病毒,人们常利用荧光蛋白分子或荧光染料对病毒和细胞进行荧光标记,但存在着荧光强度低、易光漂白等缺点,难于长时间示踪单个病毒。荧光量子点可以避免上述缺点,但其生物相容性和稳定性有待提高。因此如何避免标记材料自身的不足是一个值得研究的问题。本文利用生物相容性好的金纳米颗粒标记呼吸道合胞病毒(RSV),实现对单个病毒侵染宿主细胞过程的长时间实时成像,有利于进一步了解呼吸道合胞病毒侵染机制。具体的研究内容包括以下三个方面：1.选择性定量细胞膜表面吸附的呼吸道合胞病毒。利用RSV多克隆抗体修饰的金纳米颗粒靶向标记病毒,并以宿主细胞作为检测病毒的基底,通过统计靶向于细胞膜表面病毒所在位置的金纳米颗粒的散射信号的百分比,实现可视化定量细胞膜表面的病毒。当将一定量的病毒加入细胞基底并洗弃未侵染细胞的多余病毒后,再加入RSV多克隆抗体修饰的金纳米颗粒反应一段时间,让金纳米颗粒靶向结合到细胞表面的病毒,在暗场下成像观察发现,随着所加病毒量增加,细胞表面金纳米颗粒的散射信号逐渐增强。将所得成像数据进行分析发现病毒的量和细胞膜表面金纳米颗粒散射信号的百分比呈函数增长。此实验以细胞作为病毒检测基底,金纳米颗粒散射信号作为检测病毒量的信号,实现了可视化定量具有感染能力的病毒。由此,对具有侵染能力的病毒建立了一种选择性强,灵敏度高,操作简单的可视化分析方法。2.金纳米颗粒标记病毒侵染细胞的过程实时监控。利用链霉亲和素(SA)修饰的金纳米颗粒对病毒进行标记,在暗场下通过观察金纳米颗粒修饰的病毒的散射信号,实现长时间实时观察病毒侵染细胞的过程。SA是一种含有巯基的蛋白,可以通过金硫键修饰到金纳米颗粒表面。另外通过对病毒表面的膜蛋白进行生物素(Biotin)标记制得生物素标记病毒。由于一分子SA可以和四分子生物素高度特异性结合,故SA修饰的金纳米颗粒能用于标记生物素化的病毒。金纳米颗粒具有独特的局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)性质,因此通过在暗场显微镜下观察金纳米颗粒修饰病毒的散射信号就可长时间实时观察病毒入侵细胞的过程。经过研究发现,病毒入侵细胞的过程快速、短暂,大约1分钟左右的时间,且病毒入侵细胞可能是一个胞吞的过程。与其他荧光信号标记病毒方法相比,金纳米颗粒生物相容性好,稳定性好,不存在信号强度低和易光漂白的问题,并且这种标记策略简单、温和、对病毒感染力影响较小。3.荧光和散射双模式成像呼吸道合胞病毒的核酸。本实验将金纳米颗粒作为能量供受体和发光元件,发夹结构的DNA作为病毒核酸RNA分子检测元件,实现了病毒侵入细胞后,病毒核酸RNA复制过程的荧光和暗场双模式成像。发夹结构的DNA通过5’端的巯基偶联至金纳米颗粒表面,导致其3’端四甲基罗丹明(TAMRA)的荧光淬灭,金纳米颗粒的散射信号减弱呈暗绿色。在碱基互补配对作用下,发夹结构的茎部闭合。当发夹结构DNA的环部与病毒核酸RNA杂交,金纳米颗粒上的发夹结构打开,TAMRA荧光恢复,金纳米颗粒散射信号增强呈亮绿色。从而实现了对细胞内病毒核酸RNA荧光和暗场双模式成像。进一步研究发现,病毒侵入细胞后,在细胞膜附近区域进行大量核酸复制。发夹结构的DNA修饰的金纳米颗粒探针制备简单,且将荧光成像和暗场成像成功的结合,可能被广泛应用于生物医学成像领域。综上所述,本文利用金纳米颗粒实现了对RSV简单快速标记,利用金纳米颗粒的散射信号,借助于暗场光散射成像技术,成功实现长时间示踪病毒侵染细胞过程。本文在保证病毒自身感染力的情况下实现了对病毒的简单快速标记。选用金纳米颗粒作为标记材料避免了荧光染料和荧光蛋白的荧光信号弱、易光漂白及量子点生物相容性低、稳定性不好等缺点。本文也实现了对细胞膜表面病毒的定量检测、病毒入侵细胞过程及病毒在细胞内复制RNA核酸过程的成像。论文对病毒侵染细胞过程由外到内一一进行成像分析,这对深入了解病毒侵染细胞机制提供了条件。此外,本文采用金纳米颗粒散射信号进行成像分析的策略,有望拓展至将其它生物相容性好的纳米材料用于生物标记应用于生物医学成像领域。
【关键词】：金纳米颗粒 病毒 局域表面等离子共振 暗场散射成像
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318;TB383.1
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第1章 论文选题依据及研究内容12-26
• 1.1 论文选题依据12-24
• 1.1.1 研究意义12-13
• 1.1.2 研究现状13-24
• 1.2 研究目标、研究内容及拟解决的关键科学问题24-25
• 1.2.1 研究目标24
• 1.2.2 研究内容24-25
• 1.2.3 拟解决的关键科学问题25
• 1.3 技术路线25-26
• 第2章 选择性定量细胞表面吸附的呼吸道合胞病毒26-34
• 2.1 前言26
• 2.2 实验部分26-29
• 2.2.1 实验仪器26-27
• 2.2.2 试剂27
• 2.2.3 AuNPs的合成27-28
• 2.2.4 AuNPs的修饰28
• 2.2.5 HEp-2细胞复苏和传代培养28
• 2.2.6 RSV扩增28-29
• 2.2.7 暗场光散射成像29
• 2.3 结果与讨论29-33
• 2.3.1 AuNPs的修饰与表征29-30
• 2.3.2 AuNPs标记病毒暗场成像30-31
• 2.3.3 不同浓度病毒侵染细胞成像31-32
• 2.3.4 暗场成像定量RSV的线性曲线32-33
• 2.4 小结33-34
• 第3章 金纳米颗粒标记病毒侵染细胞的过程实时监控34-46
• 3.1 前言34-35
• 3.2 实验部分35-39
• 3.2.1 实验仪器35
• 3.2.2 试剂35-36
• 3.2.3 HEp-2细胞培养36
• 3.2.4 RSV的扩增36
• 3.2.5 病毒生物素化修饰36
• 3.2.6 AuNPs的合成36-37
• 3.2.7 AuNPs的修饰37
• 3.2.8 AuNPs生物相容性测定37
• 3.2.9 标记病毒滴度分析37-38
• 3.2.10 生物素标记病毒感染力的测定38
• 3.2.11 荧光共聚焦成像38
• 3.2.12 免疫荧光分析38
• 3.2.13 AuNPs标记病毒暗场成像38
• 3.2.14 AuNPs标记病毒侵染细胞过程的实时暗场成像38-39
• 3.3 结果与讨论39-45
• 3.3.1 AuNPs的修饰与表征39-40
• 3.3.2 AuNPs标记病毒表征40-41
• 3.3.3 AuNPs标记病毒感染力测定41-42
• 3.3.4 AuNPs标记病毒侵染细胞暗场成像42-44
• 3.3.5 实时暗场光散射成像44-45
• 3.4 小结45-46
• 第4章 荧光和散射双模式成像呼吸道合胞病毒的核酸46-52
• 4.1 前言46-47
• 4.2 实验部分47-49
• 4.2.1 实验仪器47-48
• 4.2.2 试剂48
• 4.2.3 HEp-2细胞培养48
• 4.2.4 RSV的扩增48
• 4.2.5 AuNPs合成48
• 4.2.6 AuNPs修饰上特定DNA系列48-49
• 4.2.7 DNA修饰AuNPs与靶物DNA杂交49
• 4.2.8 DNA修饰AuNPs用于病毒核酸荧光成像49
• 4.3 结果与讨论49-51
• 4.3.1 DNA修饰AuNPs表征49-50
• 4.3.2 DNA修饰AuNPs进行病毒核酸荧光成像50
• 4.3.3 DNA修饰AuNPs进行病毒核酸暗场散射成像50-51
• 4.4 小结51-52
• 第5章 全文总结与展望52-56
• 5.1 全文总结52-53
• 5.2 论文创新点53-54
• 5.3 前景展望54-56
• 5.3.1 颗粒大小均匀的AuNPs的开发54
• 5.3.2 其它生物相容性好的纳米材料的开发54
• 5.3.3 病毒暗场共定位成像应用54-56
• 参考文献56-68
• 科研成果68-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ZOU BoZhou;LIU Yue;YAN XiaoLi;HUANG ChengZhi;;Gold nanoparticles based digital color analysis for quinidine detection[J];Chinese Science Bulletin;2013年17期

  本文关键词：金纳米颗粒标记呼吸道合胞病毒入侵细胞的实时暗场光散射成像分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：334197