联合应用负载BMP-2、VEGF和TGF-β的壳聚糖纳米水凝胶缓释系统诱导成骨效果及机制的研究
发布时间：2021-08-20 16:19
目的:深入研究联合应用BMP-2、VEGF和TGF-β壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外诱导成骨的时效关系,以及诱导成骨的效率、质量和网络调控机制。方法:采用离子交联法制备负载BMP-2、VEGF或TGF-β的壳聚糖纳米缓释微球,利用壳聚糖制作温敏性微孔水凝胶,将负载生长因子的纳米缓释微球包裹入水凝胶内,制备出负载BMP-2、VEGF和TGF-β壳聚糖纳米微球水凝胶双重缓释系统。体外培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）,第一阶段实验以成骨诱导培养基（oeteogenic medium,OM）中添加BMP-2、VEGF和TGF-β的不同组合方式设计实验分组,以单纯OM培养基为对照组;第二阶段实验以OM培养基中添加不同组合的负载BMP-2、VEGF和TGF-β的壳聚糖纳米缓释系统设计实验分组,以单纯O M培养基为对照组。使用电镜、粒度仪及Elisa试剂盒等分析纳米微球粒径,形态,载药率和释放曲线等。采用CCK-8实验检测细胞的体外增殖能力,成骨效果检测采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及其活性定量检测、茜素红染色和矿化沉积定量分析4种方法。采用...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
壳聚糖纳米微球（A）及壳聚糖纳米微球水凝胶（B）制备
青岛大学硕士学位论文6图2使用NanotracwaveII进行粒径分析2.4壳聚糖纳米球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释效率测定（1)以包裹BMP-2的壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶为例，取12孔板，每组6孔，各加入2.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)，37℃水浴振荡，（2)分别于不同时间(第1、3、6、12、24、48、72h，后每隔3d，观察终点为第30天)取样离心(4°C，20000r/min)15min,每次取上清液100μL用ELISA试剂盒检测BMP-2的量,补充100μLPBS后继续振荡，累积的释药率按公式③计算：累积释药率=/M×100%③（其中V0是释放介质的去除体积，Ci是在不同时间收集的释放的BMP-2的浓度，M是样品的总BMP-2）（3)根据上述结果绘制壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶中BMP-2的释放曲线。3细胞培养（1）第一阶段实验：采用DMEM（高糖型）添加10％FBS和1％双抗（青霉素/链霉素）作为基础培养基于37℃恒温培养箱（5%CO2，100%湿度）培养细胞MC3T3-E1。在上述培养基中添加10mMβ-甘油磷酸酯，50ug/mL抗坏血酸和10-7mM地塞米松构建成骨诱导培养基。在成骨诱导培养基中单独或组合添加BMP-2（10ng/mL），VEGF（10ng/mL）和/或TGF-β1（5ng/mL）进行培养，分组如表1所示分
结果11结果1壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统1.1壳聚糖纳米微球粒径分析负载BMP-2的壳聚糖纳米微球平均粒径为197±7.1nm，PDI为0.21，Zeta电位为+35.42mV。图3壳聚糖纳米微球粒径分布1.2壳聚糖纳米微球载药率及包封率通过Elisa试剂盒检测上清液及离心沉淀洗涤液中BMP-2剩余量，负载BMP-2的壳聚糖纳米微球的BMP-2包封率为70.24±4.05％，载药率为59.84±3.06％。1.3壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外释放曲线通过Elisa试剂盒检测上清液BMP-2含量变化绘制壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外释药缓释曲线（图4），负载BMP-2壳聚糖纳米微球前48h的累积释放率为53.78±2.29％，而负载BMP-2壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统前48h的累积释放率为34.78±3.42％。负载BMP-2壳聚糖纳米微球的累积释放率在第9天为74.58±5.30％，在第18天为81.67±4.33％，在第30天为86.20±4.87％。负载BMP-2壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统在第9天的累积释放率为60.71±3.60％，第18天的累积释放率为70.46±3.30％，第30天的累积释放率为78.05±3.22％。
【参考文献】：
期刊论文
[1]控释重组人骨形态发生蛋白-2和血管内皮生长因子的微囊支架对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J]. 任前贵,张坤,任威,孙韬,李永峰,马丽波. 中国生物制品学杂志. 2019(12)
[2]Bone-conditioned medium contributes to initiation and progression of osteogenesis by exhibiting synergistic TGF-β1/BMP-2 activity[J]. Maria B.Asparuhova,Jordi Caballé-Serrano,Daniel Buser,Vivianne Chappuis. International Journal of Oral Science. 2018(04)
[3]3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损[J]. 杜国庆,孙健,李亚莉,陈立强,陈晨,邓楠,吴雨桐,李莉,王志浩. 中国组织工程研究. 2018(18)
[4]骨形成蛋白-2与其他生长因子联合应用对骨再生的影响[J]. 商玲玲,葛少华. 口腔医学. 2017(11)
[5]3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究[J]. 臧晓龙,孙健,李亚莉,陈立强,杨学财,梁立卿,杜国庆. 中国组织工程研究. 2016(16)
[6]骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体的制备及性能测定[J]. 刘峰,孙健,李亚莉,陈立强,解京森,臧晓龙. 上海口腔医学. 2015(02)
[7]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
[8]Notch信号通路对VEGF促大鼠间充质干细胞增殖的作用[J]. 廖凤玲,陈日玲,姜杉,田川. 中国实验血液学杂志. 2014(04)
[9]生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损[J]. 周庆梅,孙健,李亚莉,陈立强,许尧祥. 中国组织工程研究. 2013(21)
[10]血管内皮生长因子对骨髓源间充质干细胞增殖的影响及其信号机制[J]. 张俊,谢珊珊,韩晓霞,任金涛,吕富冉,唐俊明,郑飞,郭凌郧,杨建业,孔霞,张蕾,黄永章,王家宁. 南方医科大学学报. 2011(10)
博士论文
[1]ATRA调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及机制研究[D]. 刘洋.重庆医科大学 2014
硕士论文
[1]BMP2诱导人根尖乳头干细胞分化的作用及机制的研究[D]. 路亚婷.山东大学 2016
本文编号：3353822
【文章来源】：青岛大学山东省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
壳聚糖纳米微球（A）及壳聚糖纳米微球水凝胶（B）制备
青岛大学硕士学位论文6图2使用NanotracwaveII进行粒径分析2.4壳聚糖纳米球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释效率测定（1)以包裹BMP-2的壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶为例，取12孔板，每组6孔，各加入2.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)，37℃水浴振荡，（2)分别于不同时间(第1、3、6、12、24、48、72h，后每隔3d，观察终点为第30天)取样离心(4°C，20000r/min)15min,每次取上清液100μL用ELISA试剂盒检测BMP-2的量,补充100μLPBS后继续振荡，累积的释药率按公式③计算：累积释药率=/M×100%③（其中V0是释放介质的去除体积，Ci是在不同时间收集的释放的BMP-2的浓度，M是样品的总BMP-2）（3)根据上述结果绘制壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶中BMP-2的释放曲线。3细胞培养（1）第一阶段实验：采用DMEM（高糖型）添加10％FBS和1％双抗（青霉素/链霉素）作为基础培养基于37℃恒温培养箱（5%CO2，100%湿度）培养细胞MC3T3-E1。在上述培养基中添加10mMβ-甘油磷酸酯，50ug/mL抗坏血酸和10-7mM地塞米松构建成骨诱导培养基。在成骨诱导培养基中单独或组合添加BMP-2（10ng/mL），VEGF（10ng/mL）和/或TGF-β1（5ng/mL）进行培养，分组如表1所示分
结果11结果1壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统1.1壳聚糖纳米微球粒径分析负载BMP-2的壳聚糖纳米微球平均粒径为197±7.1nm，PDI为0.21，Zeta电位为+35.42mV。图3壳聚糖纳米微球粒径分布1.2壳聚糖纳米微球载药率及包封率通过Elisa试剂盒检测上清液及离心沉淀洗涤液中BMP-2剩余量，负载BMP-2的壳聚糖纳米微球的BMP-2包封率为70.24±4.05％，载药率为59.84±3.06％。1.3壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外释放曲线通过Elisa试剂盒检测上清液BMP-2含量变化绘制壳聚糖纳米微球及壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统体外释药缓释曲线（图4），负载BMP-2壳聚糖纳米微球前48h的累积释放率为53.78±2.29％，而负载BMP-2壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统前48h的累积释放率为34.78±3.42％。负载BMP-2壳聚糖纳米微球的累积释放率在第9天为74.58±5.30％，在第18天为81.67±4.33％，在第30天为86.20±4.87％。负载BMP-2壳聚糖纳米微球水凝胶缓释系统在第9天的累积释放率为60.71±3.60％，第18天的累积释放率为70.46±3.30％，第30天的累积释放率为78.05±3.22％。
【参考文献】：
期刊论文
[1]控释重组人骨形态发生蛋白-2和血管内皮生长因子的微囊支架对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J]. 任前贵,张坤,任威,孙韬,李永峰,马丽波. 中国生物制品学杂志. 2019(12)
[2]Bone-conditioned medium contributes to initiation and progression of osteogenesis by exhibiting synergistic TGF-β1/BMP-2 activity[J]. Maria B.Asparuhova,Jordi Caballé-Serrano,Daniel Buser,Vivianne Chappuis. International Journal of Oral Science. 2018(04)
[3]3D仿生打印组织工程骨修复下颌骨缺损[J]. 杜国庆,孙健,李亚莉,陈立强,陈晨,邓楠,吴雨桐,李莉,王志浩. 中国组织工程研究. 2018(18)
[4]骨形成蛋白-2与其他生长因子联合应用对骨再生的影响[J]. 商玲玲,葛少华. 口腔医学. 2017(11)
[5]3D生物打印构建聚乳酸羟基乙酸/纳米羟基磷灰石支架骨形态发生蛋白2缓释复合体的实验研究[J]. 臧晓龙,孙健,李亚莉,陈立强,杨学财,梁立卿,杜国庆. 中国组织工程研究. 2016(16)
[6]骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体的制备及性能测定[J]. 刘峰,孙健,李亚莉,陈立强,解京森,臧晓龙. 上海口腔医学. 2015(02)
[7]TGF-β/BMP signaling and other molecular events: regulation of osteoblastogenesis and bone formation[J]. Md Shaifur Rahman,Naznin Akhtar,Hossen Mohammad Jamil,Rajat Suvra Banik,Sikder M Asaduzzaman. Bone Research. 2015(01)
[8]Notch信号通路对VEGF促大鼠间充质干细胞增殖的作用[J]. 廖凤玲,陈日玲,姜杉,田川. 中国实验血液学杂志. 2014(04)
[9]生长因子缓释系统复合纳米支架材料修复犬下颌骨缺损[J]. 周庆梅,孙健,李亚莉,陈立强,许尧祥. 中国组织工程研究. 2013(21)
[10]血管内皮生长因子对骨髓源间充质干细胞增殖的影响及其信号机制[J]. 张俊,谢珊珊,韩晓霞,任金涛,吕富冉,唐俊明,郑飞,郭凌郧,杨建业,孔霞,张蕾,黄永章,王家宁. 南方医科大学学报. 2011(10)
博士论文
[1]ATRA调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及机制研究[D]. 刘洋.重庆医科大学 2014
硕士论文
[1]BMP2诱导人根尖乳头干细胞分化的作用及机制的研究[D]. 路亚婷.山东大学 2016
本文编号：3353822
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