微型化生物人工肝的低温保存及传质研究
发布时间：2021-09-29 14:32
低温保存可减缓细胞代谢,延长其体外存活时间,是生物人工肝存储和运输的理想方式。但低温保存过程易引发细胞损伤,制约了生物人工肝的临床应用。因此,设计合适的保护策略以抑制低温保存中的细胞损伤,是确保生物人工肝广泛应用的重要基础。本论文基于微型化的中空纤维型生物人工肝,通过对低温保存保护剂的筛选、保护剂作用机理及低温损伤机理的研究,并结合保护剂在反应器内的传质分析,提出生物人工肝低温保存的新方法。通过对低温保存保护剂筛选发现,甘草酸二铵、维生素E、海藻糖和苦参碱对细胞具有显著保护作用。低温保存中的微型化生物人工肝经这四种保护剂联合处理后,其细胞活率和胞内谷胱甘肽水平与未经保护剂处理相比,分别提高了约38%和32%。随后,对作用机理已知的保护剂进行归纳总结可知,预培养阶段发挥功效的保护剂主要为抗氧化剂,低温阶段主要为细胞膜保护剂和线粒体膜通透性转变抑制剂,而复温阶段主要为抗氧化剂、线粒体钙离子通道阻滞剂和线粒体膜通透性转变抑制剂。同时,采用1,6-二磷酸果糖提高胞内ATP含量后仍不能阻止细胞损伤的发生,证明了ATP缺失不是引发低温损伤的初始诱因。此外,经研究发现,双鼠李糖脂在低温阶段通过增加细...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1.1 生物人工肝概述
1.2 肝细胞的低温保存和超低温保存
1.2.1 低温保存及其保护剂
1.2.2 低温损伤机理
1.2.3 超低温保存
1.3 中空纤维型生物人工肝的传质研究
1.3.1 反应器传质特点及其研究现状
1.3.2 中空纤维膜扩散系数的获得方法
1.3.3 微电极技术及其在传质检测中的应用
1.4 研究思路
第二章 材料与方法
2.1 动物
2.2 试剂与器材
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要器材
2.3 培养基与所用溶液配方
2.3.1 大鼠肝细胞培养基
2.3.2 低温保存培养基
2.3.3 4×浓缩培养基
2.3.4 磷酸缓冲液(PBS)
2.3.5 细胞洗涤培养基
2.4 大鼠肝细胞收获方法
2.5 细胞培养方法
2.5.1 单层贴壁培养
2.5.2 中空纤维凝胶包埋培养
2.5.3 中空纤维柱状聚集体培养
2.6 低温保存方法
2.7 超低温保存方法
2.8 细胞相关功能分析
2.8.1 细胞活率检测
2.8.2 尿素含量分析
2.8.3 白蛋白分析
2.8.4 线粒体膜电位检测
2.8.5 活性氧自由基检测
2.8.6 胞内谷胱甘肽测定
2.8.7 胞质内游离钙离子浓度(Ca~(2+))测定
2.8.8 细胞CYP 450活性测定
2.8.9 胞内海藻糖浓度测定
2.8.10 PCR基因检测
2.8.11 胶原凝胶收缩率测定
2.9 中空纤维膜形貌及渗透特性表征
2.9.1 扫描电极观察中空纤维膜形貌
2.9.2 中空纤维膜渗透特性表征
2.10 传质相关测定及分析方法
2.10.1 针形微电极制备
2.10.2 微电极表面抗污染膜涂布
2.10.3 平板膜扩散系数测定
2.10.4 微电极检测中空纤维膜扩散系数
2.10.5 微型化透析装置测定中空纤维膜扩散系数
2.10.6 微电极测定胶原-细胞混合物的扩散系数
2.11 统计学处理
第三章 微型化生物人工肝的低温保存
3.1 肝细胞培养条件优化
3.2 低温保存保护剂筛选
3.3 保护剂合用及其使用方法的优化
3.4 双鼠李糖脂的作用
3.5 低温保存后肝细胞功能的综合评价
3.6 低温保存保护剂用于肝细胞的超低温保存
3.6.1 肝细胞的超低温保存
3.6.2 单层贴壁培养细胞活性评价
3.6.3 组织化培养细胞活性评价
3.7 本章小结
第四章 低温损伤与保护剂作用机理
4.1 有效保护剂反映低温损伤机理
4.2 苦参碱作用机理
4.2.1 苦参碱在复温阶段的保护作用
4.2.2 苦参碱在低温阶段的毒性作用
4.2.3 苦参碱对胞内游离钙离子的调节作用
4.3 双鼠李糖脂作用机理
4.3.1 双鼠李糖脂单独作用
4.3.2 双鼠李糖脂与海藻糖协同作用
4.4 保护剂合用对细胞基因表达的影响
4.5 保护剂合用对细胞骨架微丝的影响
4.6 本章小结
第五章 基于微电极的中空纤维膜传质检测方法建立
5.1 微电极检测物质浓度方法的建立及可行性验证
5.1.1 微电极检测物质浓度方法的建立
5.1.2 微电极检测物质浓度随时间变化的可行性验证
5.2 中空纤维膜扩散系数检测方法的建立
5.3 微电极检测中空纤维膜扩散系数的可靠性验证
5.3.1 微型透析器法验证
5.3.2 不同类型中空纤维膜定性验证
5.4 本章小结
第六章 微型化生物人工肝低温保存保护剂传质研究
6.1 微电极表面抗生物污染修饰
6.1.1 抗污染薄膜制备及其性能评价
6.1.2 微电极涂布抗污染膜层及其性能评价
6.2 中空纤维膜及胶原-细胞混合体系中的各种保护剂扩散系数测定
6.3 低温保存保护剂在反应器中的传质达稳定所需时间
6.4 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 总结
7.2 不足之处
7.3 展望
论文主要创新点
参考文献
作者简历
攻读学位期间发表的论文
发明专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]Hepatocyte cryopreservation:Is it time to change the strategy?[J]. Xavier Stéphenne,Mustapha Najimi,Etienne M Sokal. World Journal of Gastroenterology. 2010(01)
[2]一种用于在体监测的新型钙离子传感器的研制[J]. 任霞,胡文慧,王颖波,任恕,黄光英,马长清. 传感器与微系统. 2006(12)
[3]Current status and perspective of liver preservation solutions[J]. Xiao-Ning Feng, Xiao Xu and Shu-Sen Zheng Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2006(04)
[4]海藻糖对低温储存皮肤β-actin的mRNA转录水平及其蛋白表达的影响[J]. 贾晓明,蔡宏,马彩虹,吴志谷,姚咏明,杨毅,李绍然,陆江阳. 军医进修学院学报. 2006(05)
[5]蒽酮一硫酸法测定酵母中海藻糖的含量[J]. 谭海刚,梅英杰,关凤梅,王瑞明. 现代食品科技. 2006(01)
[6]传感器技术在体内药物分析中的应用概述[J]. 陈胜利,马长清,邓定安,任恕. 药物分析杂志. 2005(09)
[7]Evaluation of diffusion in gel entrapment cell culture within hollow fibers[J]. Dan-Qing Wu, Chong Shen, Qian Zhao, Hui Li, Qin Meng, Department of Chemical Engineering and Biochemical Engineering, Zhejiang University, 38 Zheda Road, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China Gup-Liang Zhang, Institute of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(11)
[8]原代乳猪肝细胞低温保存的初步探索[J]. 刘鸿凌,王英杰,郭海涛,刘国栋,刘俊,于乐成. 肝脏. 2002(03)
[9]微电极及其应用[J]. 潘晓明,刘积灵. 吉林化工学院学报. 2002(01)
[10]无血清培养基培养乳猪肝细胞的效果[J]. 陈钟,丁义涛,张鹤云. 世界华人消化杂志. 2002(03)
本文编号：3413877
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1.1 生物人工肝概述
1.2 肝细胞的低温保存和超低温保存
1.2.1 低温保存及其保护剂
1.2.2 低温损伤机理
1.2.3 超低温保存
1.3 中空纤维型生物人工肝的传质研究
1.3.1 反应器传质特点及其研究现状
1.3.2 中空纤维膜扩散系数的获得方法
1.3.3 微电极技术及其在传质检测中的应用
1.4 研究思路
第二章 材料与方法
2.1 动物
2.2 试剂与器材
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要器材
2.3 培养基与所用溶液配方
2.3.1 大鼠肝细胞培养基
2.3.2 低温保存培养基
2.3.3 4×浓缩培养基
2.3.4 磷酸缓冲液(PBS)
2.3.5 细胞洗涤培养基
2.4 大鼠肝细胞收获方法
2.5 细胞培养方法
2.5.1 单层贴壁培养
2.5.2 中空纤维凝胶包埋培养
2.5.3 中空纤维柱状聚集体培养
2.6 低温保存方法
2.7 超低温保存方法
2.8 细胞相关功能分析
2.8.1 细胞活率检测
2.8.2 尿素含量分析
2.8.3 白蛋白分析
2.8.4 线粒体膜电位检测
2.8.5 活性氧自由基检测
2.8.6 胞内谷胱甘肽测定
2.8.7 胞质内游离钙离子浓度(Ca~(2+))测定
2.8.8 细胞CYP 450活性测定
2.8.9 胞内海藻糖浓度测定
2.8.10 PCR基因检测
2.8.11 胶原凝胶收缩率测定
2.9 中空纤维膜形貌及渗透特性表征
2.9.1 扫描电极观察中空纤维膜形貌
2.9.2 中空纤维膜渗透特性表征
2.10 传质相关测定及分析方法
2.10.1 针形微电极制备
2.10.2 微电极表面抗污染膜涂布
2.10.3 平板膜扩散系数测定
2.10.4 微电极检测中空纤维膜扩散系数
2.10.5 微型化透析装置测定中空纤维膜扩散系数
2.10.6 微电极测定胶原-细胞混合物的扩散系数
2.11 统计学处理
第三章 微型化生物人工肝的低温保存
3.1 肝细胞培养条件优化
3.2 低温保存保护剂筛选
3.3 保护剂合用及其使用方法的优化
3.4 双鼠李糖脂的作用
3.5 低温保存后肝细胞功能的综合评价
3.6 低温保存保护剂用于肝细胞的超低温保存
3.6.1 肝细胞的超低温保存
3.6.2 单层贴壁培养细胞活性评价
3.6.3 组织化培养细胞活性评价
3.7 本章小结
第四章 低温损伤与保护剂作用机理
4.1 有效保护剂反映低温损伤机理
4.2 苦参碱作用机理
4.2.1 苦参碱在复温阶段的保护作用
4.2.2 苦参碱在低温阶段的毒性作用
4.2.3 苦参碱对胞内游离钙离子的调节作用
4.3 双鼠李糖脂作用机理
4.3.1 双鼠李糖脂单独作用
4.3.2 双鼠李糖脂与海藻糖协同作用
4.4 保护剂合用对细胞基因表达的影响
4.5 保护剂合用对细胞骨架微丝的影响
4.6 本章小结
第五章 基于微电极的中空纤维膜传质检测方法建立
5.1 微电极检测物质浓度方法的建立及可行性验证
5.1.1 微电极检测物质浓度方法的建立
5.1.2 微电极检测物质浓度随时间变化的可行性验证
5.2 中空纤维膜扩散系数检测方法的建立
5.3 微电极检测中空纤维膜扩散系数的可靠性验证
5.3.1 微型透析器法验证
5.3.2 不同类型中空纤维膜定性验证
5.4 本章小结
第六章 微型化生物人工肝低温保存保护剂传质研究
6.1 微电极表面抗生物污染修饰
6.1.1 抗污染薄膜制备及其性能评价
6.1.2 微电极涂布抗污染膜层及其性能评价
6.2 中空纤维膜及胶原-细胞混合体系中的各种保护剂扩散系数测定
6.3 低温保存保护剂在反应器中的传质达稳定所需时间
6.4 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 总结
7.2 不足之处
7.3 展望
论文主要创新点
参考文献
作者简历
攻读学位期间发表的论文
发明专利
【参考文献】：
期刊论文
[1]Hepatocyte cryopreservation:Is it time to change the strategy?[J]. Xavier Stéphenne,Mustapha Najimi,Etienne M Sokal. World Journal of Gastroenterology. 2010(01)
[2]一种用于在体监测的新型钙离子传感器的研制[J]. 任霞,胡文慧,王颖波,任恕,黄光英,马长清. 传感器与微系统. 2006(12)
[3]Current status and perspective of liver preservation solutions[J]. Xiao-Ning Feng, Xiao Xu and Shu-Sen Zheng Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2006(04)
[4]海藻糖对低温储存皮肤β-actin的mRNA转录水平及其蛋白表达的影响[J]. 贾晓明,蔡宏,马彩虹,吴志谷,姚咏明,杨毅,李绍然,陆江阳. 军医进修学院学报. 2006(05)
[5]蒽酮一硫酸法测定酵母中海藻糖的含量[J]. 谭海刚,梅英杰,关凤梅,王瑞明. 现代食品科技. 2006(01)
[6]传感器技术在体内药物分析中的应用概述[J]. 陈胜利,马长清,邓定安,任恕. 药物分析杂志. 2005(09)
[7]Evaluation of diffusion in gel entrapment cell culture within hollow fibers[J]. Dan-Qing Wu, Chong Shen, Qian Zhao, Hui Li, Qin Meng, Department of Chemical Engineering and Biochemical Engineering, Zhejiang University, 38 Zheda Road, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China Gup-Liang Zhang, Institute of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China. World Journal of Gastroenterology. 2005(11)
[8]原代乳猪肝细胞低温保存的初步探索[J]. 刘鸿凌,王英杰,郭海涛,刘国栋,刘俊,于乐成. 肝脏. 2002(03)
[9]微电极及其应用[J]. 潘晓明,刘积灵. 吉林化工学院学报. 2002(01)
[10]无血清培养基培养乳猪肝细胞的效果[J]. 陈钟,丁义涛,张鹤云. 世界华人消化杂志. 2002(03)
本文编号：3413877
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