基于金属有机骨架材料检测蛋白激酶和磷酸酶活性的荧光分析
发布时间：2021-10-08 12:15
蛋白质是生命活动的执行者。具有催化功能的酶蛋白与人体细胞的生长发育、新陈代谢等生命活动密切相关。蛋白激酶和蛋白磷酸酶相互调控的可逆磷酸化在信号转导中起着至关重要的作用,二者的活性异常将导致人体产生多种疾病。对蛋白激酶和蛋白磷酸酶的分析检测将极大促进相关的基础研究和以相应的酶为靶点的药物研发。因此,开发操作简便、成本低、灵敏度高的检测方法有着重要的研究意义和广阔的应用前景。研究了一种基于钛基金属有机骨架（MOF,Ti-MIL125-NH2）对蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）进行活性分析和抑制剂筛选的荧光分析法。该方法利用了Ti-MIL125-NH2对磷酸基团的高度特异性识别。在加入PKA后,荧光基团标记的底物多肽被磷酸化,生成的磷酸化多肽可以与Ti-MIL125-NH2的钛位点特异性配位结合。这导致了荧光富集,通过荧光光谱仪可以有效地检测到该荧光。经过对实验体系的优化（包括乙腈占比、ATP浓度、洗脱条件、材料与磷酸化体系孵育时间）,该方法在0.00005-0.01 UμL-1范围...
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白质的可逆磷酸化示意图
第一章绪论3影响。通过催化磷酸化反应，PKA在大多数细胞的发育分化、新陈代谢、基因表达等重要生理过程中发挥重要的调节作用[9]。cAMP依赖性蛋白激酶的催化过程如图1-2所示，PKA全酶由4个亚基组成，包括2个调节亚基（Regulatorysubunit）和2个催化亚基（Catalyticsubunit）。PKA在全酶状态下不具备催化底物蛋白发生磷酸化反应的能力。只有当cAMP被释放，cAMP和PKA的催化亚基结合成复合物后，催化亚基才得以分离，从而具备催化底物蛋白发生磷酸化的能力。图1-2cAMP依赖性蛋白激酶的激活机理示意图Fig.1-2SchematicdiagramofactivationmechanismofcAMP-dependentproteinkinase.本文第二章着眼科研热点，以PKA作为分析的对象，建立了一种荧光检测方法来对PKA的活性进行检测，同时也进行了抑制剂的筛选，取得了良好的性能表现。需要说明的是，本文第二章用于做线性回归方程的商业PKA是具有催化活性的PKA催化亚基，无需通过cAMP的结合激活作用即可在ATP、Mg2+和适宜的催化环境下催化底物蛋白发生磷酸化反应。1.2蛋白激酶活性检测方法蛋白激酶作为一种重要的生物分子，对它进行准确、高效的检测是至关重要的。目前，已有多种微量分析技术和高端仪器应用到蛋白激酶的活性分析中，如放射性同位素标记法[10,11]、比色法[12,13]、质谱法[14,15]、电化学法[16,17]等。虽然这些方法已经成功地用于蛋白激酶的活性检测和抑制剂的筛选，但这些方法或多或少存在一些不足之处。例如检测方法的线性范围窄、搭建检测平台费时费力、检测平台需要高端昂贵仪器的支持等。因此对蛋白激酶相关分析方法的继续研究和不断更新是非常必要的。下面按照不同的分析方法简述目前对蛋白激酶的检测。
河北大学硕士学位论文41.2.1放射性同位素标记法放射性同位素标记法（Radioisotopiclabeling），是检测蛋白激酶活性的经典方法。这种检测方法使用了放射性同位素32P或33P。由于放射性同位素的背景干扰孝灵敏度高，放射性同位素标记法对蛋白激酶的检测结果非常准确，因而也被称为蛋白激酶检测方法的“金标准”。其具体的检测原理如图1-3所示，32P由于是P的同位素，所以具有几乎相同的化学性质。在合成过程中，通过将放射性同位素32P连接到ATP的γ位来生成放射性同位素标记的[γ-32P]ATP。经过蛋白激酶的催化，[γ-32P]ATPγ位的32P被转移到底物多肽特定的氨基酸残基上。再通过后续的分离方法，将带有32P标记的磷酸化多肽分离出来，同时将未参与反应的[γ-32P]ATP洗脱[10]。最后通过放射性物质探测仪器即可进行检测并由此测得蛋白激酶的活性。图1-3放射性同位素标记法原理示意图Fig.1-3Schematicdiagramofradioisotopiclabeling.放射性同位素标记法方法简便，而且检测结果具有极高的可靠性，为蛋白激酶的相关研究起到很大帮助，但这种方法也有一些不可避免的缺点。这些缺点主要是：（1）放射性同位素32P/33P的半衰期短，需要及时更新试剂以确保结果的准确；（2）放射性同位素对环境有污染，对人体健康有危害。虽然放射性同位素标记法是蛋白激酶检测的“金标准”，但它的弊端却限制了其的广泛应用。近年来，放射性同位素标记法已经逐渐被新发展的其他检测手段所代替。1.2.2免疫反应法近年来多种非放射性的方法逐渐应用到蛋白激酶的活性分析上来。其中，免疫反应法（Immunoassay）就是一种比较常用的方法。免疫反应法的基本原理是抗原抗体反应。
本文编号：3424139
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白质的可逆磷酸化示意图
第一章绪论3影响。通过催化磷酸化反应，PKA在大多数细胞的发育分化、新陈代谢、基因表达等重要生理过程中发挥重要的调节作用[9]。cAMP依赖性蛋白激酶的催化过程如图1-2所示，PKA全酶由4个亚基组成，包括2个调节亚基（Regulatorysubunit）和2个催化亚基（Catalyticsubunit）。PKA在全酶状态下不具备催化底物蛋白发生磷酸化反应的能力。只有当cAMP被释放，cAMP和PKA的催化亚基结合成复合物后，催化亚基才得以分离，从而具备催化底物蛋白发生磷酸化的能力。图1-2cAMP依赖性蛋白激酶的激活机理示意图Fig.1-2SchematicdiagramofactivationmechanismofcAMP-dependentproteinkinase.本文第二章着眼科研热点，以PKA作为分析的对象，建立了一种荧光检测方法来对PKA的活性进行检测，同时也进行了抑制剂的筛选，取得了良好的性能表现。需要说明的是，本文第二章用于做线性回归方程的商业PKA是具有催化活性的PKA催化亚基，无需通过cAMP的结合激活作用即可在ATP、Mg2+和适宜的催化环境下催化底物蛋白发生磷酸化反应。1.2蛋白激酶活性检测方法蛋白激酶作为一种重要的生物分子，对它进行准确、高效的检测是至关重要的。目前，已有多种微量分析技术和高端仪器应用到蛋白激酶的活性分析中，如放射性同位素标记法[10,11]、比色法[12,13]、质谱法[14,15]、电化学法[16,17]等。虽然这些方法已经成功地用于蛋白激酶的活性检测和抑制剂的筛选，但这些方法或多或少存在一些不足之处。例如检测方法的线性范围窄、搭建检测平台费时费力、检测平台需要高端昂贵仪器的支持等。因此对蛋白激酶相关分析方法的继续研究和不断更新是非常必要的。下面按照不同的分析方法简述目前对蛋白激酶的检测。
河北大学硕士学位论文41.2.1放射性同位素标记法放射性同位素标记法（Radioisotopiclabeling），是检测蛋白激酶活性的经典方法。这种检测方法使用了放射性同位素32P或33P。由于放射性同位素的背景干扰孝灵敏度高，放射性同位素标记法对蛋白激酶的检测结果非常准确，因而也被称为蛋白激酶检测方法的“金标准”。其具体的检测原理如图1-3所示，32P由于是P的同位素，所以具有几乎相同的化学性质。在合成过程中，通过将放射性同位素32P连接到ATP的γ位来生成放射性同位素标记的[γ-32P]ATP。经过蛋白激酶的催化，[γ-32P]ATPγ位的32P被转移到底物多肽特定的氨基酸残基上。再通过后续的分离方法，将带有32P标记的磷酸化多肽分离出来，同时将未参与反应的[γ-32P]ATP洗脱[10]。最后通过放射性物质探测仪器即可进行检测并由此测得蛋白激酶的活性。图1-3放射性同位素标记法原理示意图Fig.1-3Schematicdiagramofradioisotopiclabeling.放射性同位素标记法方法简便，而且检测结果具有极高的可靠性，为蛋白激酶的相关研究起到很大帮助，但这种方法也有一些不可避免的缺点。这些缺点主要是：（1）放射性同位素32P/33P的半衰期短，需要及时更新试剂以确保结果的准确；（2）放射性同位素对环境有污染，对人体健康有危害。虽然放射性同位素标记法是蛋白激酶检测的“金标准”，但它的弊端却限制了其的广泛应用。近年来，放射性同位素标记法已经逐渐被新发展的其他检测手段所代替。1.2.2免疫反应法近年来多种非放射性的方法逐渐应用到蛋白激酶的活性分析上来。其中，免疫反应法（Immunoassay）就是一种比较常用的方法。免疫反应法的基本原理是抗原抗体反应。
本文编号：3424139
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