滑膜间充质干细胞/软骨细胞与ECM-PCL-HA构建关节软骨体外研究
发布时间：2021-11-20 10:14
目的:本研究观察三维条件下富含滑膜间充质干细胞/软骨细胞的脱去细胞含有细胞外基质的支架复合物成软骨能力。方法:（1）兔膝关节滑膜组织及软骨组织、腹股沟部脂肪组织分离培养,体外扩增。（2）取生长良好的第1代脂肪间充质干细胞用慢病毒介导TGF-β3转染,后接种于3D打印的聚己内酯/羟基磷灰石（PCL-HA）复合支架材料。（3）将滑膜间充质干细胞/软骨细胞接种于构建好的富细胞外基质（ECM）的支架材料体外培养构建关节软骨。（4）采用RT-PCR检测RNA水平上COL-I、COL-II、SOX-9、Aggrecan基因表达的影响。（5）采用免疫印迹法检测软骨特异性蛋白的表达。结果:（1）将接种转染后的脂肪间充质干细胞的支架复合物培养14d后,激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀,逐层扫描后细胞逐渐减少。（2）将滑膜间充质干细胞/软骨细胞混合培养于ECM-PCL-HA支架材料后,体外培养1周、2周及4周后,经实时荧光定量PCR,滑膜间充质干细胞/软骨细胞接种于ECM-PCL-HA组,单纯滑膜间充质干细胞或单纯软骨细胞接种于ECM-PCL-HA组,从时间上（1周,2周及4周）可见Aggreca...
【文章来源】：新疆医科大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
兔来源脂肪间充质干细胞（a.原代ADSCsb.第三代细胞ADSCs）
新疆医科大学硕士学位论文17图2兔来源滑膜间充质干细胞（a.原代SMSCsb.第二代细胞SMSCs）Fig.2MorphologyofRabbitsynovialmesenchymalstemcells(a.P0b.P2)图3兔来源软骨细胞（a.原代软骨细胞b.第二代软骨细胞）Fig.3MorphologyofRabbitchondrocytes(a.P0b.P2)1.2PCL-HA支架材料对滑膜间充质干细胞的细胞毒性检测使用CCK-8法检测PCL-HA支架材料浸泡提取液对滑膜间充质干细胞毒性的检测结果（如表5所示），绘制成折线图后可见，P3代中滑膜间充质干细胞从第一天至第四天呈对数生长状态，第四天达到高峰期，第六天生长逐渐进入平台期且细胞等增殖状态逐渐减慢，整体的SMSCs细胞PCL-HA支架材料的毒性检测可见呈“S”形（图4）。计算统计值两组之间结果表明P＞0.05，差异无统计学意义，提示两组细胞生长无明显差异，说明PCL-HA支架材料对SMSCs细胞无明显毒性作用，对细胞的增殖无影响。
新疆医科大学硕士学位论文18表5细胞毒性所测A值(x±s）Table5ProliferationcurvesofmeasuredvalueofA分组天数（d）1d2d3d4d5d6d7d8d9dA组0.619±0.0941.089±0.1011.852±0.1182.594±0.1672.462±0.1322.723±0.4032.801±0.2022.651±0.3271.235±0.084B组0.623±0.1141.035±0.0551.923±0.0542.585±0.2242.371±0.2252.708±0.1202.802±0.1772.705±.0.1691.184±0.141图4PCL-HA支架对滑膜间充质干细胞毒性的增殖曲线检测（注：1×103个细胞）Fig.4DetectionofPCL-HAscaffoldsontheproliferationofsynovialmesenchymalstemcells图注：A组为正常DMEM培养基，B组为PCL-HA支架材料浸泡后的DMEM。2ECM-PCL-HA支架材料的制备2.1将ADSCs用携带TGF-β3的慢病毒转染正常脂肪间充质干细胞于荧光倒置显微镜或共聚焦显微镜下无荧光显影效果，将其转染携带TGF-β3的慢病毒72h后于荧光倒置显微镜下观察，细胞核及细胞质内均可见绿色荧光显影效果（图5a）。提示携带TGF-β3的慢病毒已转染至脂肪间充质干细胞内，因其转染至细胞核内，提示将其传代后也可稳定表达（图5b）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化[J]. 杨萌,邵博,龚忠诚,宁晓婷,刘慧,克热木·阿巴斯,凌彬,尹小朋,王冰,胡露露,王玥,胡鑫,林兆全. 中国组织工程研究. 2016(11)
[2]Current research on pharmacologic and regenerative therapies for osteoarthritis[J]. Wei Zhang,Hongwei Ouyang,Crispin R Dass,Jiake Xu. Bone Research. 2015(04)
[3]慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞[J]. 刘晓昌,赵英华,杨子桧,王磊. 中国组织工程研究. 2014(37)
[4]TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究[J]. 郑东,杨述华,袁晓梅,李进,冯勇,徐亮,梅荣成. 中国矫形外科杂志. 2007(06)
本文编号：3507110
【文章来源】：新疆医科大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
兔来源脂肪间充质干细胞（a.原代ADSCsb.第三代细胞ADSCs）
新疆医科大学硕士学位论文17图2兔来源滑膜间充质干细胞（a.原代SMSCsb.第二代细胞SMSCs）Fig.2MorphologyofRabbitsynovialmesenchymalstemcells(a.P0b.P2)图3兔来源软骨细胞（a.原代软骨细胞b.第二代软骨细胞）Fig.3MorphologyofRabbitchondrocytes(a.P0b.P2)1.2PCL-HA支架材料对滑膜间充质干细胞的细胞毒性检测使用CCK-8法检测PCL-HA支架材料浸泡提取液对滑膜间充质干细胞毒性的检测结果（如表5所示），绘制成折线图后可见，P3代中滑膜间充质干细胞从第一天至第四天呈对数生长状态，第四天达到高峰期，第六天生长逐渐进入平台期且细胞等增殖状态逐渐减慢，整体的SMSCs细胞PCL-HA支架材料的毒性检测可见呈“S”形（图4）。计算统计值两组之间结果表明P＞0.05，差异无统计学意义，提示两组细胞生长无明显差异，说明PCL-HA支架材料对SMSCs细胞无明显毒性作用，对细胞的增殖无影响。
新疆医科大学硕士学位论文18表5细胞毒性所测A值(x±s）Table5ProliferationcurvesofmeasuredvalueofA分组天数（d）1d2d3d4d5d6d7d8d9dA组0.619±0.0941.089±0.1011.852±0.1182.594±0.1672.462±0.1322.723±0.4032.801±0.2022.651±0.3271.235±0.084B组0.623±0.1141.035±0.0551.923±0.0542.585±0.2242.371±0.2252.708±0.1202.802±0.1772.705±.0.1691.184±0.141图4PCL-HA支架对滑膜间充质干细胞毒性的增殖曲线检测（注：1×103个细胞）Fig.4DetectionofPCL-HAscaffoldsontheproliferationofsynovialmesenchymalstemcells图注：A组为正常DMEM培养基，B组为PCL-HA支架材料浸泡后的DMEM。2ECM-PCL-HA支架材料的制备2.1将ADSCs用携带TGF-β3的慢病毒转染正常脂肪间充质干细胞于荧光倒置显微镜或共聚焦显微镜下无荧光显影效果，将其转染携带TGF-β3的慢病毒72h后于荧光倒置显微镜下观察，细胞核及细胞质内均可见绿色荧光显影效果（图5a）。提示携带TGF-β3的慢病毒已转染至脂肪间充质干细胞内，因其转染至细胞核内，提示将其传代后也可稳定表达（图5b）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]三维环境下软骨细胞诱导滑膜间充质干细胞向软骨样细胞的分化[J]. 杨萌,邵博,龚忠诚,宁晓婷,刘慧,克热木·阿巴斯,凌彬,尹小朋,王冰,胡露露,王玥,胡鑫,林兆全. 中国组织工程研究. 2016(11)
[2]Current research on pharmacologic and regenerative therapies for osteoarthritis[J]. Wei Zhang,Hongwei Ouyang,Crispin R Dass,Jiake Xu. Bone Research. 2015(04)
[3]慢病毒介导重组质粒转染兔下颌骨骨髓间充质干细胞[J]. 刘晓昌,赵英华,杨子桧,王磊. 中国组织工程研究. 2014(37)
[4]TGF-β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究[J]. 郑东,杨述华,袁晓梅,李进,冯勇,徐亮,梅荣成. 中国矫形外科杂志. 2007(06)
本文编号：3507110
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