PDMS基底硬度与形貌协同对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

发布时间：2017-06-25 19:11

  本文关键词：PDMS基底硬度与形貌协同对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]探讨聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)基底硬度与表面形貌二者协同对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cells, rBMSCs)铺展形态、增殖以及成骨分化的影响,探索基底硬度和形貌是否能协同促进rBMSCs成骨分化,寻找利于间充质干细胞成骨分化的基底硬度和形貌范围,为材料界面改性及新骨组织工程材料的研发奠定理论基础。[方法]1、人股骨骨与细胞界面硬度和形貌的表征 利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分别测量骨与细胞界面的硬度和形貌,以此为依据制备具有不同硬度和表面形貌的PDMS基底。2、仿生骨与细胞界面硬度和形貌的PDMS基底的制备利用电子束曝光及等离子体刻蚀技术制作具有不同脊槽结构的硅片模板,复模得到具有不同硬度和形貌的PDMS基底。分组：A组硬度3.5 MPa,无脊槽结构；B组硬度3.5 MPa,槽、脊宽300 nm；C组硬度3.5 MPa,槽、脊宽1800 nm; D组硬度0.27 MPa,无脊槽结构；E组硬度0.27 MPa,槽、脊宽为300 nm；F组硬度0.27 MPa,槽、脊宽1800 nm。3、不同硬度和形貌PDMS基底上rBMSCs增殖、形态与成骨分化检测在以上各组PDMS基底上培养rBMSCs,利用倒置荧光显微镜观察rBMSCs的形态,CCK-8试剂盒检测rBMSCs的增殖情况,碱性磷酸酶(alkalinephosphatase, ALP)试剂盒检测rBMSCs的ALP活性,免疫荧光技术检测骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)及Ⅰ型胶原(collagen type I, COLI)的表达,qRT-PCR检测Runx2(runt-related transcription factor 2) mRNA的表达。[结果]1、骨与细胞界面的硬度和形貌,即细胞外基质的硬度和形貌。发现构成细胞外基质主要成分的胶原纤维的直径为289±118nm、365±140nm、198±98 nm。而细胞外基质表面由胶原蛋白、蛋白聚糖、粘多糖等复合物组成的网状结构的硬度为0.93±0.09 MPa、3.58±0.14MPa、2.44±0.20 MPa。2、按质量比5：1与33：1混合184预聚物和184固化剂所得PDMS基底的硬度为3.5-±-0.16 MPa和0.27±0.015 MPa,SEM测量复型得到的PDMS基底表面脊槽宽分别为300 nm和1 800nm。3、在3.5 MPa的PDMS基底上,rBMSCs铺展充分,细胞面积大,呈多角形,细胞骨架排列紧张；在0.27 MPa的PDMS基底上,rBMSCs面积较小,呈圆球形,胞内骨架蛋白较少。在相同硬度条件下,脊、槽宽为1 800nm的PDMS基底对rBMSCs铺展有明显的引导作用,细胞沿着脊槽方向呈长梭形铺展；而在脊、槽宽为300 nm的PDMS基底及无脊槽结构的平面PDMS基底上,rBMSCs任意铺展,呈多角形。rBMSCs在硬度为3.5 MPa的PDMS基底上增殖率明显高于在0.27 MPa的PDMS基底上的增殖率,而在脊、槽宽分别为300 nm、1800nm的PDMS基底及无脊槽结构的平面PDMS基底上rBMSCs的增殖无明显差异。硬度相同的条件下,脊、槽宽为300 nm的PDMS基底上ALP活性,OCN、COL!及Runx2 mRNA表达量均明显高于脊、槽宽为1 800 nm的PDMS基底及无脊槽结构的平面PDMS基底；在形貌相同的条件下,3.5 MPa基底上ALP活性,OCN、COLI及Runx2 mRNA表达量与0.271MPa基底相比亦增高。[结论]1、基底硬度和形貌均能影响rBMSCs的形态。2、基底硬度促进rBMSCs增殖更明显。3、硬基底与脊槽结构能协同促进rBMSCs成骨分化,硬度3.5 MPa、脊槽宽为300nm的基底促rBMSCs成骨分化趋势更显著。4、本实验研究结果有助于了解物理因素在某些疾病(如骨质疏松)发病机制过程中的作用,并可为骨组织工程新材料的研发提供理论基础。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 成骨分化 硬度 形貌
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 缩略词表8-9
• 中文摘要9-11
• 英文摘要11-14
• 1 绪论14-18
• 1.1 问题的提出与研究意义14-15
• 1.1.1 问题的提出14-15
• 1.1.2 研究意义15
• 1.2 本文研究目的和内容15-18
• 1.2.1 研究目的15
• 1.2.2 研究内容15-16
• 1.2.3 技术路线16-17
• 1.2.4 创新点17-18
• 2 人股骨骨与细胞界面形貌和硬度的表征18-24
• 2.1 引言18
• 2.2 实验材料18-19
• 2.2.1 实验样品18
• 2.2.2 实验仪器18-19
• 2.2.3 主要实验试剂19
• 2.2.4 主要实验试剂的配制19
• 2.3 实验方法19-21
• 2.3.1 骨小梁样品的制作19
• 2.3.2 扫描电子显微镜检测骨与细胞界面的形貌19-20
• 2.3.3 原子力显微镜检测骨与细胞界面的硬度20-21
• 2.3.4 数据分析21
• 2.4 实验结果21-22
• 2.4.1 骨与细胞界面的形貌21-22
• 2.4.2 骨与细胞界面的硬度22
• 2.5 分析讨论22-23
• 2.6 小结23-24
• 3 大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定24-30
• 3.1 引言24
• 3.2 实验材料24-26
• 3.2.1 实验细胞24
• 3.2.2 实验仪器24-25
• 3.2.3 主要实验试剂25
• 3.2.4 主要实验试剂的配制25-26
• 3.3 实验方法26-27
• 3.3.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养26
• 3.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定26-27
• 3.4 实验结果27-28
• 3.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞体外培养形态观察27-28
• 3.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞表型鉴定28
• 3.5 分析讨论28-29
• 3.6 小结29-30
• 4 聚二甲基硅氧烷基底的制备及骨髓间充质干细胞在不同硬度和形貌基底上的增殖、形态与成骨分化30-54
• 4.1 引言30
• 4.2 实验材料30-33
• 4.2.1 实验细胞30
• 4.2.2 实验仪器30-31
• 4.2.3 主要实验试剂31-32
• 4.2.4 主要实验试剂的配制32-33
• 4.3 实验方法33-41
• 4.3.1 微机控制回弹力试验机测定聚二甲基硅氧烷的硬度33-34
• 4.3.2 聚二甲基硅氧烷基底的制备34
• 4.3.3 扫描电子显微镜检测聚二甲基硅氧烷表面的脊槽结构34
• 4.3.4 聚二甲基硅氧烷基底的表面处理34-35
• 4.3.5 细胞CCK-8实验检测细胞增殖35-36
• 4.3.6 聚二甲基硅氧烷基底上细胞形态观察36-37
• 4.3.7 骨钙蛋白与Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色37
• 4.3.8 碱性磷酸酶活性检测37-39
• 4.3.9 qRT-PCR检测Runx2 mRNA的表达39-41
• 4.3.10 数据分析41
• 4.4 实验结果41-51
• 4.4.1 不同质量比例混合184预聚物/184固化剂聚二甲基硅氧烷基底的硬度41-42
• 4.4.2 具有脊槽结构硅片表面的形貌42
• 4.4.3 具有脊槽结构聚二甲基硅氧烷基底的形貌42-43
• 4.4.4 大鼠骨髓间充质干细胞在不同硬度与形貌聚二甲基硅氧烷基底上的增殖43-44
• 4.4.5 大鼠骨髓间充质干细胞在不同硬度与形貌聚二甲基硅氧烷基底上的形态44-46
• 4.4.6 不同硬度与形貌聚二甲基硅氧烷基底上大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化差异46-51
• 4.5 分析讨论51-52
• 4.6 小结52-54
• 5 全文总结及展望54-56
• 5.1 主要结论54
• 5.2 展望54-56
• 参考文献56-62
• 综述62-73
• 参考文献69-73
• 攻读学位期间获得的学术成果73
• 攻读学位期间获奖情况73-74
• 致谢74

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