基于脱细胞基质支架的输尿管组织工程研究

发布时间：2017-08-04 20:40

  本文关键词：基于脱细胞基质支架的输尿管组织工程研究

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【摘要】：输尿管作为腹膜后位器官,损伤发生的机率很低,但近年来随着腔镜技术在临床中的广泛应用,输尿管损伤发生的概率逐年升高。常规手术治疗方式(输尿管断端吻合,输尿管的再植,膀胱成形术等)可以恢复输尿管结构的连续性,而不能完全恢复其功能,且常伴有一些术后并发症,例如：复发性狭窄,漏尿以及肾脏损害等。随着组织工程技术在泌尿系统中的广泛应用,为输尿管的修复重建提供了新的契机。组织工程学融合了材料学、生命科学和工程学的理念,属于前沿交叉学科领域,研究的最终目的是体外构建具有生物学功能的工程化输尿管,替换体内受损的输尿管组织,达到临床治愈的目标。随着组织工程技术在泌尿系统广泛而深入的研究,体外构建工程化输尿管的研究也有了很多突破性的进展,但尚未构建出理想的工程化输尿管组织,用于临床的治疗。其中支架材料问题是其主要原因之一。输尿管细胞外基质的结构和成分较为复杂,现阶段技术条件很难在体外完全模拟出细胞外基质的微环境。脱细胞技术的出现和发展,使得制备脱细胞基质材料成为可能,受到了广泛的关注和研究。脱细胞基质材料独有的特点是将细胞成分从组织或器官中清除,同时能够很好地保留细胞外基质的结构和成分,因而是较为理想的组织工程支架材料。输尿管脱细胞基质常用的制备方法为物理搅拌同时结合化学洗涤剂的洗脱作用,来达到脱细胞效果,这一制备过程需消耗较长的时间,且制备的输尿管脱细胞基质的成分常遭到破坏。此外,长时间的搅拌和化学洗涤剂作用,也会破坏脱细胞基质的结构,进而影响组织工程输尿管的构建。因此,探寻一种快速,便捷的脱细胞方案,使制备的输尿管脱细胞基质的细胞成分被完全清除,同时细胞外基质结构和成分得到很好地保留,对以后的输尿管再造研究具有重要的意义。既往的研究报道,细胞外基质在调控干细胞分化中扮演着重要的角色。DeQuach等人的研究表明,骨骼肌脱细胞基质能够促进肌源性干细胞向骨骼肌细胞分化,心脏脱细胞基质能够促进胚胎干细胞向心肌细胞分化。有文献报道脱细胞基质的硬度在调控间充质干细胞分化起到重要的作用,质地较为坚硬的基质有利于间充质干细胞的成骨分化,相反质地较软的基质更有利于间充质干细胞的成脂分化。此外,也有关于细胞外基质中某些组分可以促进干细胞的分化的报道。但关于输尿管脱细胞基质成分在促进干细胞分化方面的研究尚未有报道。基于以上问题的分析,本论文主要从以下三方面进行了相关研究：第一部分：输尿管脱细胞基质的灌注制备及条件优化目的：探索灌注系统在制备输尿管脱细胞基质中的可行性,并对制备的输尿管脱细胞基质进行系统且详细地评价。方法：利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3个不同的灌注组,单纯SDS组、单纯TritonX-100组以及联合组(TritonX-100+SDS)。结果：HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留,DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson's三色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结构。结论：灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可作为输尿管组织工程再造。第二部分：输尿管脱细胞基质的生物相容性评价和再细胞化目的：对制备的输尿管脱细胞基质进行生物相容性评价,并进行再细胞化研究。方法：通过AO/PI染色和MTT检测评价输尿管脱细胞基质的生物相容性；将犬膀胱平滑肌细胞种植在输尿管脱细胞基质的表面,观察脱细胞基质中细胞的生长行为。结果：AO/PI染色和MTT检测显示平滑肌细胞可在输尿管脱细胞基质浸提液中生长和增殖;HE染色、DAPI染色和PCNA染色显示犬膀胱平滑肌细胞可在输尿管脱细胞基质中粘附、生长、迁移和增殖。结论：制备的输尿管脱细胞基质具有良好的生物相容性,可用做输尿管组织工程的支架材料。第三部分：输尿管脱细胞基质的化学成分诱导脂肪干细胞的分化目的：探寻输尿管脱细胞基质的化学成分是否可诱导干细胞分化。方法：将犬脂肪干细胞种植在铺有输尿管脱细胞基质消化液的盖玻片上,观察脂肪干细胞的分化情况。结果：免疫荧光染色显示脂肪干细胞向平滑肌细胞分化,Western Blot检测显示有平滑肌蛋白的表达。结论：输尿管脱细胞基质的化学成分可以诱导犬脂肪干细胞向平滑肌细胞分化。综上所述,本论文将灌注系统引入到输尿管脱细胞基质的制备中,并成功筛选出一套适用于制备犬输尿管脱细胞基质的脱细胞方案。同时对制备的输尿管脱细胞基质进行了系统且详细的评价,证实制备的输尿管脱细胞基质很好地清除了细胞核成分,同时较好地保留了输尿管的三维结构和生物活性成分。并且验证了所制备的输尿管脱细胞基质具有良好的生物相容性,进行了再细胞化实验,表明优化后的脱细胞方案所制备的输尿管脱细胞基质可用作输尿管组织工程的支架材料。进一步研究表明输尿管脱细胞基质的化学组分可促进犬脂肪干细胞向平滑肌细胞分化。
【关键词】：输尿管 脱细胞基质 组织工程 支架
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R699.4
【目录】：

• 中英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 第一部分：输尿管脱细胞基质的灌注制备及条件优化17-27
• 1. 材料17-19
• 2. 方法19-23
• 3. 结果23-25
• 4. 讨论25-27
• 第二部分：输尿管脱细胞基质的生物相容性评价和再细胞化27-35
• 1. 材料27-28
• 2. 方法28-31
• 3. 结果31-33
• 4. 讨论33-35
• 第三部分：输尿管脱细胞基质的化学成分诱导脂肪干细胞的分化35-43
• 1. 材料35-36
• 2. 方法36-39
• 3. 结果39-41
• 4. 讨论41-43
• 参考文献43-47
• 综述47-53
• 参考文献51-53
• 攻读学位期间发表文章情况53-54
• 致谢54

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本文编号：621619