低强度流体剪切力—材料表面化学共刺激对成骨细胞增殖和分化的影响

发布时间：2017-08-07 06:15

  本文关键词：低强度流体剪切力—材料表面化学共刺激对成骨细胞增殖和分化的影响

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【摘要】：种子细胞是骨组织工程重要组成部分。调节种子细胞生理功能增强生骨能力至关重要。细胞的生理功能受外界微环境的影响，包括物理微环境和化学微环境，且物理微环境和化学微环境同时存在，共同作用，调控细胞功能。了解细胞微环境，尤其是多种细胞微环境共同作用，调控细胞生理功能的基本规律及其机制对于合理地人工设计和调控细胞微环境，实现骨组织工程策略有重要的指导作用。本研究旨在考察流体剪应力和基底化学共同作用对成骨细胞行为的影响，并探讨可能的影响机制。 对骨组织而言，流体剪切力是骨系细胞物理微环境中一种重要的机械刺激，能通过力转导途径将力信号转换成化学信号，激活多种信号通路并有效促进骨生成。细胞骨架和细胞粘附是实现力转导的重要组件。另一方面，骨组织工程支架作为一种人工胞外基质，在为细胞提供物理支撑的同时为细胞提供必要的化学微环境。有研究表明，支架材料的化学性质可通过调节骨系细胞粘附、形态、迁移等细胞行为而改变其生理功能。据此，我们假设，基底化学特性可影响骨系细胞对流体剪切力的响应，继而调节骨生成。 为验证我们的假设并探明流体剪应力-基底化学对骨系细胞的影响规律，，本研究开展了以下主要工作： ①制备带有不同化学基团的材料表面：利用自组装单分子层（Self-assemblymonolayer, SAM）技术在载玻片表面接枝不同的化学基团（-OH, NH_2， CH_3），同时，以空白载玻片作为对照基底，并采用静态水接触角验证了各SAM的基底化学性质。 ②对成骨细胞施加剪切力刺激：将体外培养的原代SD大鼠成骨细胞分别接种于不同基底化学表面，待细胞完全融合后，借助于平行平板流动腔装置对成骨细胞施加大小为5dyn/cm~2剪切力刺激，作用时间分别为1h或0h，并记为FSS~+组（实验组）和FSS-组。 ③评价细胞生理功能：FSS作用后，对细胞进行继续培养，在不同的培养阶段，分别利用流式细胞仪、碱性磷酸酶试剂盒、免疫荧光技术、Western blot等实验方法分别考察FSS-组和FSS~+组成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、细胞骨架F-actin组装和黏着斑分布以及胞外基质蛋白（纤连蛋白和Ⅰ型胶原）的含量变化。 主要研究结果和结论是： ①低强度FSS促进成骨细胞增殖并抑制其早期分化；改变细胞形态与黏着斑分布；对培养初期基底上的胞外基质蛋白含量有明显的影响，但随着细胞培养时间的延长，影响逐渐消失。 ②5dyn/cm~2FSS对成骨细胞生理功能的影响受材料表面化学调节。5dyn/cm~2FSS作用后，OH表面和Blank表面S期细胞比例的增长率明显高于CH_3表面和NH_2表面；ALP活性下降率遵循OH Blank≈CH_3 NH_2的规律；各基底胞外基质蛋白含量的增长率呈相似的变化规律。总之，OH表面、CH_3表面以及Blank表面的成骨细胞对5dyn/cm~2FSS的响应程度强于NH_2表面细胞。 ③细胞形态和黏着斑可能是这种差异性响应的内在原因。FSS作用前，成骨细胞在NH_2表面上铺展充分，形成的黏着斑体积较大，5dyn/cm~2低强度FSS刺激可能不足以使NH_2表面成骨细胞产生明显的响应。FSS作用后，NH_2表面细胞的细胞骨架和黏着斑无明显变化，而OH表面和CH_3表面细胞有明显变化。此结果提示，基底化学通过影响细胞骨架和粘附来调控成骨细胞对FSS的响应敏感性。 ④低强度FSS作用下成骨细胞的Fn和COL I表达量具有化学依赖性：CH_3表面的Fn和COL I分泌量增大；OH表面的Fn增大而COL I含量降低；NH_2表面的Fn和COL I含量无明显变化。 ⑤虽然F-actin组装和粘着斑形成显示OH表面细胞对低强度FSS的响应较高，但是其COL I含量却较低，这可能与OH表面极度亲水性而限制了成骨细胞胞外基质的组装有关。因此，在骨组织材料表面设计中还需充分考虑材料表面性质对细胞胞外基质网络组装的影响。
【关键词】：骨组织工程 流体剪切力 化学基团 成骨细胞 响应程度
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 主要缩略词10-11
• 1 绪论11-16
• 1.1 问题的提出及研究意义11
• 1.2 国内外研究现状11-15
• 1.2.1 机械刺激对成骨细胞影响的研究进展11-13
• 1.2.2 化学刺激对成骨细胞的影响13-15
• 1.3 研究目的和研究内容15-16
• 2 自组装单分子层材料的制备16-21
• 2.1 引言16-17
• 2.2 自组装单分子层玻璃表面的制备17-18
• 2.2.1 实验材料17
• 2.2.2 实验方法17-18
• 2.3 结果分析与讨论18-20
• 2.4 本章小结20-21
• 3 成骨细胞分离、培养及鉴定21-26
• 3.1 引言21
• 3.2 实验部分21-24
• 3.2.1 实验材料21-22
• 3.2.2 实验方法22-24
• 3.3 结果分析与讨论24-25
• 3.3.1 成骨细胞形态观察24
• 3.3.2 茜素红染色24-25
• 3.4 本章小结25-26
• 4 FSS 对不同基底上成骨细胞增殖、早期分化的影响26-35
• 4.1 引言26-28
• 4.2 实验部分28-30
• 4.2.1 FSS 的施加28-29
• 4.2.2 细胞周期检测29-30
• 4.2.3 细胞 ALP 活性检测30
• 4.3 数据处理30-31
• 4.4 结果分析与讨论31-34
• 4.4.1 低强度 FSS 促进成骨细胞生长且具有基底化学特异性31-33
• 4.4.2 低强度 FSS 抑制成骨细胞早期分化且具有基底化学特异性33-34
• 4.5 本章小结34-35
• 5 低强度 FSS 对不同基底上成骨细胞细胞形态和黏着斑的影响35-41
• 5.1 引言35
• 5.2 实验部分35-36
• 5.2.1 实验材料35-36
• 5.2.2 实验方法36
• 5.3 结果与分析36-40
• 5.3.1 免疫荧光染色结果分析36-38
• 5.3.2 细胞骨架在细胞对 FSS 刺激响应程度调节中的作用38-39
• 5.3.3 细胞骨架与黏着斑在 FSS 力转导中的关联39
• 5.3.4 细胞形态和黏着斑在细胞对 FSS 刺激响应程度调节中的作用39-40
• 5.4 本章小结40-41
• 6 低强度 FSS 对不同基底上成骨细胞胞外基质表达与组装的影响41-52
• 6.1 前言41-42
• 6.2 实验部分42-44
• 6.2.1 实验材料42-43
• 6.2.2 实验方法43-44
• 6.3 数据处理44
• 6.4 结果与分析44-50
• 6.4.1 Fn 蛋白的 Western blot 检测结果44-47
• 6.4.2 COL I 蛋白的 Western blot 检测结果47-49
• 6.4.3 关于 FSS 作用下成骨细胞胞外基质蛋白 Fn 和 COL I 含量变化的分析49-50
• 6.5 本章小结50-52
• 7 结论及后续工作建议52-54
• 7.1 结论52-53
• 7.2 后续工作建议53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-63
• 附录63

【参考文献】

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本文编号：633173