三维人工皮肤构建及鼠李糖脂促皮肤伤口愈合研究

发布时间：2017-08-08 02:05

  本文关键词：三维人工皮肤构建及鼠李糖脂促皮肤伤口愈合研究

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【摘要】：皮肤是人体最大的器官,其不仅作为与外界环境接触的屏障,还起到维持体内稳态的作用。由于烧伤和慢性愈合伤口的大量发生,自体皮肤移植不足以满足皮肤移植的需求,这使人工皮肤受到越来越多的关注。其中,包含表皮层与真皮层的3D人工皮肤更接近真实的皮肤,在移植及作为皮肤研究模型上的应用价值明显高于其他人工皮肤。本文采用自行分离和培养的原代人皮肤成纤维细胞与角质细胞,并优化3D人工皮肤的构建,在降低成本的基础上获得更好的人工皮肤。此外,鼠李糖脂是一种优良的生物表面活性剂,具有优越的表/界面活性、低毒性等特点,在医药领域有广阔的应用前景。本文利用体外模型考察鼠李糖脂对皮肤伤口愈合和抗疤痕修复的作用。首先,从小儿环切手术后的包皮中分离原代人皮肤成纤维细胞和角质细胞。研究发现,角质细胞在原代成纤维细胞饲养层上的增殖情况优于鼠成纤维细胞系(NIH3T3)饲养层；饲养层的接种密度对角质细胞的生长有很大影响,其与角质细胞接种密度为1：1时,角质细胞的增殖最优。此外,消化角质细胞的酶也在很大程度上影响细胞活率和增殖,国产的胰酶不能将角质细胞消化下来,且对细胞的损伤大,而胰酶替代物TrypLETE可以用来消化角质细胞,且对细胞的损伤小。其次,将角质细胞接种于胶原包埋的成纤维细胞,气提培养获得3D人工皮肤。本文比较角质细胞增殖培养基Epi Ⅰ中钙离子的含量对表皮形成的影响,发现与高钙培养基相比,不含钙或低钙的培养基培养皮肤时,可获得更完整的表皮层。随后,本文采用鼠尾和牛尾Ⅰ型胶原构建真皮层,比较两者的收缩性,测量人工皮肤的水接触角以考察其疏水性,并以苏木素-伊红染色(HE)、天狼猩红及免疫荧光染色进一步表征人工皮肤的组织形态。结果显示,牛尾Ⅰ型胶原制作的皮肤在培养21天时,其面积只下降了21%,而鼠尾Ⅰ型胶原制作的皮肤收缩至原来的一半。牛尾Ⅰ型胶原构建的皮肤表面水接触角与人皮肤接近,表明其比鼠尾Ⅰ型胶原构建的皮肤疏水性更好。HE和免疫荧光染色观察组织形态,可见完整的皮肤结构,含表皮层与真皮层;且牛尾Ⅰ型胶原构建的皮肤表皮层与鼠尾Ⅰ型胶原相比呈更多层。最后,本文采用体外模型评价了鼠李糖脂的促皮肤伤口愈合及抗伤疤作用。通过2D划痕愈合实验分析,发现鼠李糖脂能促进角质细胞系HaCaT的迁移,及在成纤维细胞和角质细胞共培养时,鼠李糖脂也有明显的促细胞迁移效果；初步阐明了其促伤口愈合的原因。此外,鼠李糖脂能抑制肌成纤维细胞引起的胶原收缩,降低其胶原分泌和重排,说明了其潜在的抗疤痕修复作用和机理。综上所述,采用原代成纤维细胞和角质细胞,以牛尾Ⅰ型胶原为真皮层支架,可构建疏水性和结构完整性均接近真实皮肤的3D人工皮肤。此外,通过体外皮肤划痕伤口愈合及抗疤痕模型的研究,初步证实了鼠李糖脂促伤口愈合和抗疤痕的效果及机理。
【关键词】：人工皮肤 角质细胞 成纤维细胞 胶原 细胞角蛋白14 饲养层 鼠李糖脂 伤口愈合 抗疤痕
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.1;R622
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 文献综述12-25
• 1.1 皮肤的结构与功能12-13
• 1.2 皮肤的伤口愈合及疤痕形成13-15
• 1.3 皮肤的体外模型15-20
• 1.3.1 2D模型15-16
• 1.3.2 3D人工皮肤模型16-19
• 1.3.3 3D人工皮肤的应用19-20
• 1.4 促伤口愈合及抗疤痕药物20-21
• 1.5 鼠李糖脂及其促伤口愈合的研究21-24
• 1.5.1 鼠李糖脂的结构与理化性质21-22
• 1.5.2 鼠李糖脂的生物安全性22-23
• 1.5.3 鼠李糖脂促伤口愈合和抗疤痕的研究23-24
• 1.6 本课题研究思路24-25
• 第二章 材料与方法25-34
• 2.1 实验仪器和试剂25-26
• 2.1.1 主要仪器25
• 2.1.2 实验试剂25-26
• 2.2 原代细胞的分离与培养26-29
• 2.2.1 人皮肤成纤维细胞的分离26-27
• 2.2.2 人皮肤成纤维细胞的培养27
• 2.2.3 人皮肤角质细胞的分离27-28
• 2.2.4 人皮肤角质细胞的培养28
• 2.2.5 角质细胞的鉴定28-29
• 2.3 3D人工皮肤的构建和表征29-32
• 2.3.1 Ⅰ型胶原的制备29
• 2.3.2 3D人工皮肤的构建29-30
• 2.3.3 皮肤组织石蜡包埋切片30
• 2.3.4 皮肤组织切片HE染色30-31
• 2.3.5 皮肤组织切片免疫荧光染色31
• 2.3.6 皮肤组织切片天狼猩红染色31
• 2.3.7 接触角测量31-32
• 2.4 鼠李糖脂对胶原包埋成纤维细胞和肌成纤维细胞的研究32-33
• 2.4.1 成纤维细胞的诱导转化32
• 2.4.2 胶原收缩32
• 2.4.3 胶原凝胶的天狼猩红染色32
• 2.4.4 胶原凝胶的Masson三色染色32-33
• 2.4.5 胶原凝胶的免疫荧光染色33
• 2.5 划痕愈合实验33
• 2.6 细胞增殖实验33
• 2.7 数据分析33-34
• 第三章 人皮肤成纤维和角质细胞的分离与培养34-42
• 3.1 引言34
• 3.2 人皮肤成纤维细胞的分离与培养34-35
• 3.2.1 人皮肤成纤维细胞的分离34-35
• 3.2.2 人皮肤成纤维细胞的培养与传代35
• 3.3 角质细胞的分离与培养35-39
• 3.3.1 无血清培养基培养角质细胞35-36
• 3.3.2 饲养层及含血清培养基培养角质细胞36-39
• 3.4 角质细胞的消化与传代39-40
• 3.5 角质细胞鉴定40-41
• 3.6 本章小结41-42
• 第四章 3D人工皮肤的体外构建42-47
• 4.1 引言42
• 4.2 3D人工皮肤的培养条件优化42-43
• 4.3 牛尾和鼠尾Ⅰ型胶原构建的3D人工皮肤比较43-46
• 4.3.1 牛尾和鼠尾Ⅰ型胶原构建皮肤的收缩性43-44
• 4.3.2 牛尾和鼠尾Ⅰ型胶原构建皮肤的疏水性比较44
• 4.3.3 牛尾和鼠尾Ⅰ型胶原构建人工皮肤的HE染色44-45
• 4.3.4 牛尾和鼠尾Ⅰ型胶原构建皮肤的天狼猩红染色45-46
• 4.4 牛尾Ⅰ型胶原构建皮肤的免疫荧光染色46
• 4.5 本章小结46-47
• 第五章 体外皮肤模型用于鼠李糖脂促伤口愈合及抗疤痕研究47-60
• 5.1 引言47
• 5.2 鼠李糖脂对2D皮肤伤口模型的伤口愈合作用47-53
• 5.2.1 鼠李糖脂对成纤维细胞迁移的影响47-49
• 5.2.2 鼠李糖脂对角质细胞迁移的影响49-50
• 5.2.3 鼠李糖脂对成纤维和角质细胞共培养时两种细胞迁移的影响50-52
• 5.2.4 鼠李糖脂对角质细胞增殖的影响52-53
• 5.3 鼠李糖脂抗疤痕机理研究53-59
• 5.3.1 成纤维细胞诱导形成肌成纤维细胞54
• 5.3.2 鼠李糖脂对成纤维/肌成纤维细胞胶原收缩能力的影响54-55
• 5.3.3 鼠李糖脂下调肌成纤维细胞的α-SMA表达55-56
• 5.3.4 鼠李糖脂对成纤维/肌成纤维细胞的毒性56-57
• 5.3.5 鼠李糖脂抑制肌成纤维细胞的胶原分泌及重组57-59
• 5.4 本章小结59-60
• 第6章 结论与展望60-62
• 6.1 总结60
• 6.2 不足之处60-61
• 6.3 展望61-62
• 论文主要创新点62-63
• 参考文献63-73
• 作者简介73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 马丹;赵晓娟;付溥博;张西萌;魏海燕;刘莉;曾静;;3D人工皮肤模型用于化学品皮肤刺激性实验的评估[J];卫生研究;2014年01期

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本文编号：637714