食管去细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程食管的初步研究

发布时间：2017-08-13 15:21

  本文关键词：食管去细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程食管的初步研究

  更多相关文章： 组织工程 食管 细胞外基质 骨髓间充质干细胞

【摘要】：食管是连接咽和胃的通道,食团经吞咽从咽部进入食管,通过食管进入胃腔。食管器质性疾病或动力障碍性疾病或功能性食管病均可以影响食管的功能。食管疾病包括食管的畸形、运动失调、炎症和肿瘤。有些无症状或症状轻微,对健康影响不大。有些则影响进食,甚至威胁生命，需手术治疗。食道疾病的治疗方法主要由手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗，这几种方法都没有很好的提高中末期食管疾病的治愈率。20世纪中期，人们开始用自身的其他组织或器官来替代受损的食管，然而手术创伤大，术后并发症多，所以人们一直在努力寻找一种理想的人工食管代替物。随着材料科学的进步，人工食管的研究进入了崭新阶段。目前可用于人工食管的生物替代材料主要包括人工合成的可降解高分子材料和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）衍生材料，后者又包括生物大分子无结构材料和脱细胞的天然的ECM材料。由于无细胞食管支架能逐渐被吸收，同时能诱导组织特异性结构重塑，因而受到研究者的重点关注。干细胞技术是再生医学研究领域的前沿技术之一，近年来，干细胞治疗手段也为多种疾病提供了新的研究策略。BMSCs是干细胞其中的一种，可以作为组织工程器官的种子细胞。 方法： 采用化学去垢剂脱氧胆酸钠（Sodium desoxycholate，SD）使食管组织有效去细胞，制成天然食管细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）支架，用HE染色进行去细胞效果的观察，用Masson染色、VG染色、免疫组织化学染色等进行组织学观察。运用扫描电镜、透射电镜进行超微结构观察。分离提取大鼠骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，，BMSCs），体外培养、扩增并进行流式细胞学鉴定。以低浓度过氧乙酸溶液对ECM支架进行灭菌；将BMSCs接种于食管ECM支架上进行复合培养，最后做HE染色观察。 结果： 1.经处理后所得ECM为白色、质地柔软、弹性良好，制得的天然管状ECM成形良好，经HE染色可观察到，ECM内部无细胞成分残留；经Masson染色、VG染色、免疫组织化学染色可观察到ECM的胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白与去细胞之前相比较没有显著差异。经扫描电镜、透射电镜观察可见ECM具有三维网状的立体空间结构；采用过氧乙酸溶液对ECM灭菌后进行细菌培养，结果显示灭菌效果良好。 2.采用全骨髓贴壁法分离培BMSCs细胞，扩增培养后取第三代（P3）细胞进行流式细胞仪检测。CD29、CD90表达率分别为98.21%、99.58%、CD3、CD45表达率分别为2.43%和2.38%，符合BMSCs的抗原表达，证明P3代BMSCs的纯度达到98%以上。 3.BMSCs与去细胞食管ECM支架接种复合培养，经HE染色后可见大量蓝染的细胞核结构，连接紧密，孔隙内亦可见细胞生长，证明ECM与BMSCs的接种复合良好。 结论： 利用全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs在P3代纯度可达到98%以上。脱氧胆酸钠联合DNaseI对食管进行去细胞，有效去除了组织中细胞成分，保留了细胞外基质；支架的形态、大小、体积未发生明显改变，证实获得理想的去细胞食管支架。用二次沉淀法将组织与细胞复合培养，BMSCs可在支架内较好生长。
【关键词】：组织工程 食管 细胞外基质 骨髓间充质干细胞
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文对照11-12
• 第1章 绪论12-20
• 1.1 组织工程与再生医学12-13
• 1.2 组织工程支架材料13-16
• 1.2.1 去细胞方法14-16
• 1.3 种子细胞的选择16-17
• 1.4 组织工程食管17-20
• 第二章 材料与试剂20-23
• 2.1 实验动物20
• 2.2 器材与设备20
• 2.3 主要试剂20-21
• 2.4 主要试剂的配制21-23
• 第三章 实验方法23-30
• 3.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定23-24
• 3.1.1 全骨髓贴壁法分离培养 BMSCs23
• 3.1.2 骨髓间充质干细胞的传代培养23
• 3.1.3 BMSCs 的冻存23-24
• 3.1.4 BMSCs 的鉴定24
• 3.2 组织工程食道支架的制备24
• 3.3 组织工程食道支架生物学特性研究24-28
• 3.3.1 组织学检测24-27
• 3.3.2 扫描电镜观察脱细胞前后食管27
• 3.3.3 透射电镜观察脱细胞前后食管27
• 3.3.4 去细胞前后食管 DNA 定量检测27-28
• 3.4 种子细胞与支架的体外种植实验28-29
• 3.4.1 支架的灭菌28
• 3.4.2 将细胞种植于支架上28-29
• 3.5 再细胞化支架的生物学特性研究29-30
• 3.5.1 再细胞化支架HE染色29-30
• 第四章 实验结果30-38
• 4.1 BMSCs 的分离培养与鉴定30-31
• 4.1.1 BMSCs 的分离培养30
• 4.1.2 BMSCs 的表面特异标记鉴定30-31
• 4.2 组织工程食道支架的生物学特性分析31-36
• 4.2.1 大鼠食管的分离结果31
• 4.2.2 去细胞食管支架的特殊染色及免疫组织化学染色31-34
• 4.2.3 电镜观察去细胞前后食管腔表面34-36
• 4.2.4 去细胞前后食管 DNA 含量36
• 4.3 再细胞化食道支架生物学特性分析36-38
• 4.3.1 再细胞化食管的 HE 染色36-38
• 第五章 讨论38-41
• 结论41-42
• 参考文献42-46
• 作者简介及攻读学位期间发表研究成果46-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 Shobha Mareddy;Ross Crawford;;Clonal Characterization of Bone Marrow Derived Stem Cells and Their Application for Bone Regeneration[J];International Journal of Oral Science;2010年03期

2 张文杰;曹谊林;;组织工程的突破与挑战——组织工程国家工程中心科研进展[J];中国科学:生命科学;2014年02期

3 Giorgia Totonelli;Panagiotis Maghsoudlou;Jonathan M Fishman;Giuseppe Orlando;Tahera Ansari;Paul Sibbons;Martin A Birchall;Agostino Pierro;Simon Eaton;Paolo De Coppi;;Esophageal tissue engineering:A new approach for esophageal replacement[J];World Journal of Gastroenterology;2012年47期

4 Joshua Schroeder;Janina Kueper;Kaplan Leon;Meir Liebergall;;Stem cells for spine surgery[J];World Journal of Stem Cells;2015年01期

5 Shima Salmasi;Deepak M Kalaskar;Wai-Weng Yoon;Gordon W Blunn;Alexander M Seifalian;;Role of nanotopography in the development of tissue engineered 3D organs and tissues using mesenchymal stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

本文编号：667972