微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙生物材料骨诱导性的作用研究

发布时间：2017-08-15 04:13

  本文关键词：微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙生物材料骨诱导性的作用研究

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【摘要】：一、背景目前,各种高能量损伤导致患者发生创伤及骨组织缺损的情况越来越多,骨组织工程学应运而生。骨组织工程学是用工程学和生命科学原理,以骨髓间充质干细胞、成骨细胞等种子细胞,在体外培养并扩增后,与天然或人工合成的可降解支架材料复合形成组织工程骨,移植到患者骨缺损部位进行损伤修复。在多种生物材料中,人工合成的骨替代材料,多孔磷酸钙生物材料是其中的代表。多孔磷酸钙生物材料特殊的制备工艺、孔径结构及材料表面特征等多方面原因使其具有骨诱导性能。目前,多孔磷酸钙生物材料骨诱导过程及机制经国内外大量学者的探索已有了一定的理论基础,但其诱导机理还存在很多未解之谜。本课题我们试图对间充质干细胞在多孔磷酸钙生物材料骨诱导中的作用进行研究,进一步了解多孔磷酸钙生物材料的骨诱导机制,使其更好地应用于临床患者骨缺损的修复。二、目的运用细胞膜荧光染料PKH-26及PKH-67标记MSCs,体内示踪探讨MSCs在多孔磷酸钙生物材料骨诱导中的作用,进一步了解多孔磷酸钙生物材料的骨诱导机制,使多孔磷酸钙生物材料更好的治疗因高能量损伤或炎症导致的骨质缺损。三、方法1.兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定选用兔BMSCs作为种子细胞,梯度密度离心法分离,贴壁法培养,并对其进行传代、鉴定,确保最终实验所用的细胞为分裂稳定且分化潜能具有多向性的细胞。2.荧光标记BMSCs取生长状态良好3代BMSCs,经胰蛋白酶消化,制作单细胞悬液。按照sigma公司提供的步骤对上述BMSCs进行PKH-26和PKH-67荧光标记,然后进行如下实验:(1)流式细胞仪准确检测BMSCs的标记率;(2)标记后接种细胞于培养皿和放置盖玻片的培养板内,荧光显微镜观察刚标记的细胞悬液和24h后细胞的标记效果;(3)检测标记前后BMSCs的生物学性状;(4)和金世植骨灵复合后植于兔臀肌内,3、7、12、15周标本不脱钙树脂包埋切片,荧光显微镜观察,确定PKH-26及PKH-67体内示踪荧光效果及示踪时间。3.动物手术操作实验用兔36只随机分为三组,每组12只,A组为血管注射组,B组为局部注射组,C组为对照组。操作完毕后记录顺序并标记。术后由西部战区兰州总医院动物中心饲养。给予充足的食物和饮水,饲养笼垫料保持干燥,术后观察。4.BMP-2基因表达量测定实验动物处死后,分批取含材料周围1cm组织的标本,剔除软组织新鲜标本液氮冷冻,RT-PCR分析BMP-2基因表达量。5.组织学观察实验动物处死后,取材行4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,进行Masson染色和Alkaline Phospatase免疫组化及Collagen I免疫组化观察各实验组的成骨活力及新生骨生成情况。6.统计学分析采用统计软件SPSS 19.0进行,单因素方差分析(ANOVA),数据以((?)±s)标准差表示,组间两两比较用LSD检验法。P0.05为差异显著,有统计学意义。四、研究结果1.BMSCs可稳定传至第三代,流式细胞仪检测,BMSCs CD 90阳性表达,阳性率95.24%,CD 45阴性表达。PKH-26及PKH-67荧光标记即时后荧光显微镜镜下观察发现BMSCs成圆球形,荧光均匀分布于细胞膜表面;24 h后BMSCs荧光稳定表达,细胞呈梭形排列。MTT检测及成骨和成脂诱导实验显示荧光标记不影响其生物学性状。PKH-26及PKH-67染色阳性率分别为93.65%及91.37%。2.BMSCs荧光体内标记,荧光显微镜下观察3、7、12、15周各时间点PKH-26及PKH-67荧光都能稳定表达,在组织切片可见广泛分布的红色或绿色标记的荧光光点。15周时PKH-26荧光表达强度稳定,PKH-67荧光强度稍有减弱。3.术后实验用兔用空气栓塞法处死取材,硬组织切片荧光显微镜观察显示,A组在3、7、12周荧光分布均匀,强度稳定表达,B组在3周分布不均,7到12周分布趋于均匀,对照C组无荧光;BMP-2基因表达量测定实验组A、B组与对照组C组在不同时间段BMP-2基因表达量都有统计学意义(P0.05),A组与B组之间在不同时间段差异也有统计学意义(P0.05)。4.组织学结果Masson染色显示,A、B实验组和C组对照组从7周开始都有骨小梁形成,但新生骨和胶原纤维组织量在各个时间节点从A组到C组递减。免疫组织化学结果显示ALP和COL I表达与上述一致。五、研究结论1、本实验分离、培养的BMSCs,经形态学观察、流式细胞仪测试鉴定,细胞为BMSCs,复合标准。2、PKH-26和PKH-67作为BMSCs的荧光标记物,不影响BMSCs的形态、增殖和分化。3、多孔磷酸钙生物材料诱导微环境中间充质干细胞向人工骨材料贴附,并增殖分化为成骨细胞,进而形成新生骨,周围血管及体液中的间充质干细胞均是成骨细胞来源,血管来源的间充质干细胞起主要作用。4、本实验研究成果可为下一步体内实验奠定基础。
【关键词】：多孔磷酸钙生物材料 BMSCs PKH-26 荧光标记 骨组织工程
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R68
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-25
• 1 多孔磷酸钙生物材料骨诱导性的研究进展13-17
• 2 间充质干细胞的研究进展17-22
• 3 间充质干细胞的标记22-25
• 实验一 骨髓间充质干细胞体外标记及体内示踪研究25-35
• 1 材料与仪器25-27
• 2 实验方法27-29
• 3 结果29-34
• 4 讨论34-35
• 实验二 骨髓间充质干细胞在材料成骨中的作用研究35-48
• 1 材料与仪器35-37
• 2 实验方法37-41
• 3 结果41-46
• 4 讨论46-48
• 小结48-49
• 参考文献49-58
• 个人简历和研究成果58-59
• 致谢59

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本文编号：676194