后发性白内障与人工晶状体材料的体外实验研究

发布时间：2017-08-17 00:26

  本文关键词：后发性白内障与人工晶状体材料的体外实验研究

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【摘要】：背景白内障是全球首位致盲疾病,手术是唯一的治疗选择。超声乳化晶状体摘除联合人工晶状体植入术是最主要的手术方式,术后可能出现角膜水肿、眼内炎、黄斑水肿、后发性白内障等,其中后发性白内障是远期影响患者术后视力的最主要原因。后发性白内障是指晶状体上皮细胞向后囊膜移行、黏附、增殖及其上皮细胞-间充质细胞转化并分泌各种蛋白及其各型胶原纤维而使后囊膜发生混浊的过程,且后囊膜的收缩可使人工晶状体移位、脱位等。后发性白内障主要与患者的病史、手术技术、人工晶状体等有关,其中人工晶状体是决定性因素。人工晶状体的参数包括：外形设计、材料组成等,临床上人工晶状体材料主要有疏水性丙烯酸酯、亲水性丙烯酸酯、硅凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。大量研究证明人工晶状体的方形边缘设计一定程度上能有效降低后发性白内障的发生,而后发性白内障与人工晶状体材料是否有关存在争论；而不同的研究报道关于不同材料人工晶状体导致后发性白内障的发生未得到一致结论；国内外关于后发性白内障与人工晶状体材料关系的体外实验研究较少。大量研究证实后发性白内障是多因素、多细胞因子及其多信号通路共同参与的过程,而前辈们关于细胞因子、人工晶状体及后发性白内障的研究主要集中于在动物眼植入人工晶状体后房水中相关细胞因子的检测,而相关细胞因子是来源晶状体上皮细胞还是来源于术后房水循坏的破坏未有明确定论,细胞因子的分泌与人工晶状体材料的关系国内外少见相关报道。TGF-β2在后发性白内障进程中的重要作用已达到共识,大量研究报道也证实IL-6,MMP-2和MMP-9参与后发性白内障的发生,而TGF-β2、IL-6 MMP-2及MMP-9的表达和人工晶状体材料的关系尚未见相关报道。第一部分不同材料人工晶状体囊膜生物相容性的实验研究[目的]本实验旨在通过人晶状体上皮细胞对不同材料人工晶状体黏附增殖、细胞形态变化及其上皮细胞一间充质细胞转化的情况,探索后发性白内障与人工晶状体材料的关系、囊膜生物相容性最佳的人工晶状体材料及其后发性白内障可能的发生机制。[方法]1.细胞来源人晶状体上皮细胞购置于American Type Culture Collection (ATCC)公司HLEC-B3系,复苏HLEC-B3,并反复传代、冻存、复苏以确保细胞的数量及其质量。2.分组将疏水性丙烯酸酯人工晶状体、亲水丙烯酸酯人工晶状体、硅凝胶人工晶状体、PMMA人工晶状体,分为A组(PC156C55,PMMA)、B组(Crystalens HD,硅凝胶),C组(Akreos Advance Optics Aspheric Lens,亲水性丙烯酸酯),D1组(Envista,疏水性丙烯酸酯),D2组(ZCB00 Lens,疏水性丙烯酸酯),D3组(Acrysof,疏水性丙烯酸酯)。3.黏附实验人晶状体上皮细胞分别种植于疏水性丙烯酸酯人工晶状体、亲水性丙烯酸酯人工晶状体、硅凝胶人工晶状体、PMMA人工晶状体并培养6h、24 h后,在倒置相差显微镜下观察人工晶状体表面黏附细胞的数量及其形态并拍照。4.增殖计数通过CCK-8实验检测人工晶状体表面培养24 h后人晶状体上皮细胞的增殖情况。5.EMT实验在人工晶状体表面继续培养48 h后,对人工晶状体表面细胞进行以a-SMA为标记蛋白的免疫荧光,在荧光显微镜下拍照并计数EMT的转化率。6.HE染色培养后的人工晶状体做HE染色,观察培养72 h后人工晶状体表面细胞的形态及其增殖情况。7.数据分析所有结果采用SPSS20.0软件做统计学分析,计量资料以mean±standard deviation表示,各组间的比较以one-way ANOVA分析,两两比较采用LSD检验,a=0.05为检验水准,认为P0.05为差异有统计学意义。[结果]1.细胞形态正常培养的人晶状体上皮细胞呈典型的上皮细胞样形态,为不规则的三边形、长椭圆形、圆形为主。2.黏附实验1)细胞种植6h后,多数细胞紧贴人工晶状体表面生长,在显微镜低倍镜下(100X)疏水性丙烯酸酯人工晶状体和硅凝胶人工晶状体表面黏附的细胞数较多,且三种疏水性丙烯酸酯人工晶状体表面黏附细胞无明显差异,PMMA人工晶状体次之,且PMMA人工晶状体表面可见黑色细胞团,亲水性丙烯酸酯黏附的细胞最少,表面较多折光性强的小圆形细胞；高倍镜下(400X)观察疏水性丙烯酸酯人工晶状体、硅凝胶人工晶状体及其亲水性丙烯酸酯人工晶状体表面黏附细胞形态以典型上皮样细胞为主,为不规则三边型,长方形,椭圆形为主,尚有贴壁不牢的圆形细胞,细胞与细胞之间形态清晰,偶见1、2个长纤维型细胞；PMMA人工晶状体表面黏附细胞许多聚集成团,增殖伸展的细胞完全融合,细胞形态模糊,在细胞团周围可见典型的长纤维型细胞。(2)细胞培养24 h后,在低倍镜下(100X)亲水性丙烯酸酯人工晶状体表面黏附细胞大部分脱壁,呈现为折光性弱的暗小圆形细胞,其它组人工晶状体表面黏附细胞明显增殖,细胞数明显多于培养6h时；高倍镜(400X)下观察,亲水性丙烯酸酯人工晶状体表面细胞仅有几个细胞贴壁生长并伸展成不规则三边形及四边形；其余各组人工晶状体表面细胞均伸展生长,大多数细胞融合,疏水性丙烯酸酯人工晶状体,硅凝胶人工晶状体表面黏附细胞大多数仍为长椭圆形的上皮样细胞为主,但可见数个典型纺锤型细胞；PMMA表面的人晶状体上皮细胞减少,大部分细胞聚集成团,细胞团周围可见典型的纺锤型成纤维细胞。3.增殖计数人工晶状体表面细胞增殖反应CCK-8各组OD值的结果显示：D3(0.2384±0.007)D2(0.2338±0.002)D1(0.2260±0.005)B(0.1781±0.007)A(0.1580±0.007)C(0.1242±0.002)；组间有统计学意义(P0.0001)；其中,D1与D2组之间,表面细胞增殖无统计学意义(P=0.155),其余各组两两之间具有显著性差异(P0.01)。4.EMT实验C组亲水性丙烯酸酯人工晶状体表面细胞贴壁不牢,随着延长培养,几乎无人晶状体上皮细胞黏附,人工晶状体表面未见荧光；其余各组人工晶状体表面细胞免疫荧光结果示：A组,B组,D1组,D2组,D3组表面为蓝染的核和绿荧光的a-SMA,其中三组疏水性丙烯酸人工晶状体表面较多蓝色的细胞核,每组约7-8个带有绿荧光的细胞,硅凝胶人工晶状体细胞较多,同样约7-8个带有绿荧光的细胞,而PMMA组细胞极少,而几乎所有细胞均出现绿荧光的a-SMA纤维；在荧光显微镜下计算各表面细胞上皮细胞-间充质细胞转化率结果显示：A(84.16±10.48)%B(17.33±5.71)%D1(14.22±4.64)%D2(13.99±9.11)%D3(9.98±3.80)%；其中A组同B、D1、D2、D3组之间转化率之间均有统计学意义(P0.001),而B、D1、D2、D3之间均无统计学差异。5.HE染色结果培养72 h后人工晶状体表面细胞的HE染色结果示：A、 B、C、D1、D2、D3组表面生长的人晶状体上皮细胞核蓝色,细胞质为淡红色；B、D1、D2、 D3组细胞明显较A组多,其细胞结构完整,轮廓不清,胞核清晰,为椭圆形,大小差异不明显,高倍镜下(400X),细胞几乎全部融合,偶见正在分裂的细胞核及其细胞核凝集、核固缩和核碎裂现象；C组人工晶状体表面可见染色的细胞,细胞结构不完整,部分细胞未见细胞核,细胞质内偶见大空泡,几乎充满整个细胞质,细胞核大小不一,形状各异,有四边形、三角形、五边形、小圆形及椭圆形；而A组细胞数明显较少,大多聚集成团,细胞核层叠,胞核染色深,核固缩现象明显,偶见核碎裂,胞质内可见碎裂的丝状细胞核。[结论]在体外细胞实验中,人工晶状体的囊膜生物相容性与人工晶状体的材料是相关的；从人工晶状体表面黏附的细胞形态,增殖数及其EMT免疫荧光分析,疏水性丙烯酸类人工晶状体具有较好的囊膜生物相容性,其次为硅凝胶晶状体、PMMA人工晶状体；后发性白内障的发展可能与人工晶状体表面黏附的细胞数量及其增殖形式有关,且人工晶状体表面一定数量的人晶状体上皮细胞单层增殖有利于后发性白内障的预防。第二部分人晶状体上皮细胞细胞因子的表达[目的]探索体外培养的人晶状体上皮细胞是否表达TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,并探究细胞因子的表达和人工晶状体材料的关系。[方法]1、将人晶状体上皮细胞种植在人工晶状体表面并培养24 h,将培养液收集于离心管内并置于-80℃冰箱内；2、依次缓慢将培养液复温并将其分装成4部分,分别对培养液进行TGF-β2、 IL-6、MMP-2和MMP-9 ELISA检测；3、所有数据采用SPSS Statistics 20.0统计软件进行统计学处理,计量资料以mean±tandard deviation表示,各组间的比较以one-way ANOVA分析,两两比较采用LSD检验,以a=0.05为检验水准,认为P0.05为差异有统计学意义。[结果]在人工晶状体与人晶状体上皮细胞混合培养24h后的培养液中能检测出TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,其中IL-6和MMP-9的分泌水平趋势大致相同,以PMMA人工晶状体组分泌最高,其次为疏水性丙烯酸酯人工晶状体组,硅凝胶人工晶状体,亲水性丙烯酸酯人工晶状体较低,而TGF-β2和MMP-2的表达水平以疏水性丙烯酸人工晶状体组最高,其次为硅凝胶人工晶状体组,PMMA组和亲水性丙烯酸酯组较低；TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9的分泌水平各组间的差异均无统计学差异(P0.05)。[结论]人晶状体上皮细胞能合成分泌TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,且人工晶状体可能诱导人晶状体上皮合成分泌TGF-β2、IL-6、MMP-2和MMP-9,其分泌水平可能同人工晶状体的材料无关。
【关键词】：人工晶状体 人晶状体上皮细胞 后发性白内障 囊膜生物相容性 人晶状体上皮细胞 人工晶状体 TGF-β _2 IL-6 MMP-2 MMP-9
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R779.66;R318.18
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-19
• 第一章 不同材料人工晶状体囊膜生物相容性的实验研究19-40
• 1 仪器及试剂19-20
• 1.1 主要仪器及材料19-20
• 1.2 主要试剂20
• 2 实验方法20-24
• 3 结果24-27
• 3.1 正常培养人晶状体上皮细胞形态为典型上皮样细胞24
• 3.2 黏附结果24-25
• 3.3 CCK-8增殖结果25
• 3.4 EMT免疫荧光结果25-26
• 3.5 HE染色结果26-27
• 4 讨论27-30
• 5 结论30-32
• 6 附图32-40
• 第二章 人晶状体上皮细胞细胞因子的表达40-49
• 1 材料与试剂40
• 1.1 主要材料40
• 1.2 主要试剂40
• 2 实验方法40-43
• 3 结果43-44
• 3.1 IL-6分泌结果43
• 3.2 TGF-β2分泌结果43
• 3.3 MMP-2分泌结果43-44
• 3.4 MMP-9分泌结果44
• 4 讨论44-47
• 5 小结47
• 6 附图47-49
• 第三章 总结49-50
• 参考文献50-58
• 附录A 中英文对照缩略词表58-59
• 附录B 成果59-60
• 综述60-87
• 参考文献76-87
• 致谢87-89

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1 黄琪;后发性白内障与人工晶状体材料的体外实验研究[D];南方医科大学;2016年

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