犬骨髓间充质干细胞细胞膜片的体外构建与鉴定

发布时间：2017-08-18 00:26

本文关键词：犬骨髓间充质干细胞细胞膜片的体外构建与鉴定

【摘要】：目的： 1.通过对犬进行体外分离、培养、扩增和进一步的纯化获得骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs),从而获得大量骨组织工程所需种子细胞,满足骨组织工程的需要。 2.鉴定BMSCs干细胞成骨分化能力,用成骨诱导培养基诱导BMSCs向成骨方向分化,并鉴定其成骨分化效果。 3.采用简易细胞膜片的方法制备犬骨髓间充质干细胞膜片并对其生物学特性进行鉴定。方法： 1、BMSCs的体外培养：取新生健康杂种幼犬一只,用无菌髓针穿刺胫骨抽取骨髓,采用全骨髓贴壁法培养原代8-10天后,按1：3的比例、每2-3天／次的频率传代。 2、对BMSCs的体外成骨能力鉴定：用地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠l0mmol/L、抗坏血酸50mg/L按一定比例配制成骨诱导液,对第3代BMSCs诱导14至21d,用茜素红染色检测矿化结节的形成,试剂盒检测ALP含量的表达,鉴定其成骨能力。 3、实验中,我们采用了简易细胞膜片的方法将犬BMSCs制备成完整的细胞膜片,同时检测了膜片的生物学性能。 4、流式细胞法检测细胞膜片的周期检测膜片的活力,通过HE染色和免疫组化从组织学水平观察其结构,通过透射电镜从超微水平观察其结构,通过荧光定量PCRmRNA水平检测细胞膜片细胞外基质的情况,通过成骨诱导来进一步检测其成骨能力。结果： 1.BMSCs的体外实验结果:BMSCs培养8-10d后可覆盖瓶底,可以进行传代,通过快速的细胞增殖,细胞生长状况良好,一直保持BMSCs长梭形的典型形态,整体呈旋涡式排列的生长状态。 2.BMSCs体外成骨能力鉴定的结果:BMSCs在体外被成功的诱导成骨细胞,表现为茜素红染色可见阳性钙结节;与未诱导组相比,ALP的含量呈上升趋势,各个时间点与未诱导组存在着显著差异(P0.05)。 3.细胞膜片获得：经过7-10天连续培养,培养皿底可见半透明乳白色薄膜样物质,将细胞膜片小心完整刮下,分离后膜片收缩成不规则型态,但保持了一定的弹性,同时具有一定的机械性能和可操作性,证明其可以用于后续实验。 4.细胞膜片的鉴定：流式结果表明细胞膜片的活力良好,HE染色结果表明膜片由3-4层细胞及细胞外基质组成,厚约20微米,免疫组化和荧光定量PCR结果分别从组织学和mRNA水平说明了细胞外基质中存在大量的Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白,透射电镜结果从超微结构上说明细胞仍然保存了细胞活力,并分泌有细胞外基质,细胞与细胞间存在连接。结论：本研究证实了用全骨髓贴壁分离法可大量扩增和纯化犬骨髓间充质干细胞,该方法简单易行,所获的细胞可于体外成功诱导后向成骨细胞分化。本实验以犬骨髓间充质干细胞作为种子细胞,体外培养,构建出完整的细胞膜片,有效地实现了种子细胞的收获和转移,并对其理化性质、组织学结构及成骨作用作了系统性研究,为临床骨移植修复提供新的思路。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 细胞膜片 成骨诱导
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
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