新型聚乙烯亚胺纳米凝胶携带miRNA质粒抑制大鼠Kupffer细胞核因子κB的表达

发布时间：2017-08-18 06:12

  本文关键词：新型聚乙烯亚胺纳米凝胶携带miRNA质粒抑制大鼠Kupffer细胞核因子κB的表达

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【摘要】：目的：研究新型聚乙烯亚胺纳米凝胶(PEI-NP)携带小、RNA (miRNA)质粒沉默大鼠Kupffer细胞(KC)内核因子κB (NF-κB)的表达。方法：1.设定LPSNs与miRNA梯度质量比(30：1、25：1、20：1、15：1、10:1、5:1、2:1)37℃普通水平摇床混合30 min后,凝胶电泳检测PEI-NP装载miRNA质粒的容量；再以PEI-NP/miRNA质粒混合物转染RAW264.7细胞后分别采用CCK-8法检测细胞毒性,annexin V-FITC/PI孵育后再利用流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡。从而获得LPSNs载荷质粒最适质量比。2.根据LPSNs最适载荷质粒的质量比,以PEI-NP/miRNA质粒混合物转染RAW264.7细胞,分别在转染细胞12h、24h和48h后采用流式细胞仪检测转染率,实时定量PCR (qRT-PCR)检测RAW264.7细胞NF-κB mRNA水平,Western blot法检测RAW264.7细胞NF-κB蛋白水平,从而获得LPSNs介导miRNA质粒转染体外巨噬细胞的效率。12只清洁级SD大鼠随机分为转染组和空载组,每组6只。以PEI-NP/miRNA质粒混合后,经门静脉微量泵入SD大鼠肝脏。6h后,每组取3只大鼠处死,取其肝脏进行透射电镜观察PEI-NP分布,剩余的SD大鼠继续饲养。48 h后取剩余大鼠肝脏,分别用qRT-PCR和Western blot检测NF-KB P65 mRNA或蛋白的表达,免疫组织化学技术检测rJF-kB P65在KC内的表达,从而获得LPSNs介导miRNA质粒转染体内KC的情况。结果：1.凝胶电泳测得PEI-NP/miRNA质粒质量比大于20：1时载荷率等于100%,两者质量比小于5：1时载荷率等于0。CCK-8测得PEI-NP/miRNA质粒质量比=20：1刺激12h细胞活性为0.940±0.034,均比PEI-NP/miRNA=30:1细胞活性高(0.901±0.054)(P0.05)和PEI-NP/miRNA=25:1细胞活性(0.927+0.036) (P0.05)。在PEI-NP/ miRNA质粒不同质量比刺激细胞48 h内,细胞活性均大于90%。流式细胞仪测得PEI-NP/miRNA=30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1的凋亡率分别为(9.00+0.28)%、(7.62+0.55)%、(7.32+0.23)%、(6.27+0.09)% 、 (5.90+0.21)%、(2.05+0.09)%, 其中PEI-NP/miRNA=20:1凋亡率,比PEI-NP/miRNA=30:1和 PEI-NP/miRNA=25:1低。2.流式细胞仪检测12、24、48 h,转染率分别为(1.76±0.28)%、(13.03±1.64)%、(33.47±2.01)%, 48h转染率显著高于24 h、12 h。与对照组相比,PEI-NP/miRNA转染的RAW264.7细胞NF-κB蛋白含量显著下降,透射电镜观察到RAW264.7细胞内有大量PEI-NP。肝脏组织透射电镜只在KC内观察到PEI-NP分布；免疫组织化学染色结果显示,转染组肝脏KC内NF-κB蛋白与空载组相比表达下降。结论：1.新型PEI-NP载荷外源基因的能力强,使实现高效转染的设想成为可能。在PEI-NP/miRNA质粒不同质量比刺激细胞48 h内,细胞活性均大于90%,细胞毒性较小,满足细胞转染需求。细胞凋亡率随PEI-NP浓度的增加而上升,与细胞毒性实验结果相似。2. PEI-NP能携带miRNA质粒顺利的进入体外巨噬细胞,并且在48 h时发挥的作用最明显。PEI-NP携带niRNA质粒能成功转染体内KC并沉默NF-κB的表达。
【关键词】：聚乙烯亚胺纳米凝胶 Kupffer细胞 microRNA 核因子κB
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 第一部分 LPSNs毒性与载荷率实验14-21
• 1 材料与方法14-18
• 1.1 材料14-15
• 1.2 方法15-18
• 2 结果18-19
• 2.1 PEI-NP/miRNA质粒载荷率18-19
• 2.2 PEI-NP/miRNA质粒转染RAW264.7细胞活性19
• 2.3 细胞凋亡率19
• 3 讨论19-21
• 第二部分 LPSNs介导miRNA质粒转KC的效率21-30
• 1 材料与方法21-27
• 1.1 材料21-23
• 1.2 方法23-27
• 2 结果27-28
• 2.1 RAW264.7细胞转染率27-28
• 2.2 转染RAW264.7细胞的形态特点和体外转染效果28
• 2.3 体内转染效果28
• 3 讨论28-30
• 全文总结30-31
• 参考文献31-34
• 实验附图34-40
• 文献综述40-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50
• 在读期间发表论文50

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本文编号：693014