功能性自组装多肽水凝胶负载脂肪间充质干细胞治疗家兔后肢缺血

发布时间：2017-08-18 17:04

  本文关键词：功能性自组装多肽水凝胶负载脂肪间充质干细胞治疗家兔后肢缺血

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【摘要】：目的：在应用干细胞移植治疗缺血性疾病中,改进传统的局部注射单纯干细胞悬液或者动脉腔内注射干细胞等方法,使用功能性自组装多肽水凝胶支架负载脂肪间充质干细胞并移植到家兔后肢缺血模型,来观察功能性自组装多肽水凝胶负载脂肪间充质干细胞移植,相对于单纯干细胞移植方案,是否达到更好的治疗缺血性疾病的效果,从而为干细胞移植治疗缺血性疾病做出新的探索。方法：使用胶原酶消化法从脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞,行原代培养并传代扩增,测试其生长、增殖特性并对其进行免疫表型、多向诱导分化鉴定,以证明其干细胞属性。合成自组装多肽分子RADA16-I和附加VEGF模拟片段的功能性多肽序列KLT,使用生物级无菌超纯水溶解多肽粉末,并将RADA16-I多肽溶液和KLT多肽溶液以1：1的体积比例混合制备功能性自组装多肽RADA/KLT,行超声混匀、过滤灭菌后,行原子力显微镜检测。将RADA/KLT多肽溶液加入24孔板中的transwell、室,使用PBS通过小室基底膜诱发多肽溶液自组装成水凝胶,制备水凝胶样本行扫描电镜检测,而后使用培养基中和水凝胶内的成份,来制备可以用来三维培养细胞的水凝胶,并将脂肪间充质干细胞接种到不同培养条件的RADA16-I和RADA/KLT水凝胶中进行三维培养。使用AO/EB染色法观察脂肪间充质干细胞在水凝胶中的存活情况,以此来探讨细胞与水凝胶的相容性、安全性。制作家兔后肢缺血模型,并在术后对分组的家兔分别移植负载脂肪间充质干细胞的功能性自组装多肽水凝胶、单纯脂肪间充质干细胞悬液、PBS等,移植后观察家兔后肢的一般状况、脉搏、皮温、血压等,并行后肢数字减影动脉造影术,30d后取后肢肌肉标本切片并行HE染色评估组织存活状况并作评分,行血管内皮细胞免疫荧光染色并计数染色阳性细胞,行统计学分析移植负载干细胞的功能性自组装多肽水凝胶组是否达到更好的治疗效果。结果：贴壁的脂肪间充质干细胞表现了成纤维细胞样形态,并逐渐展现出了较高的增殖活性,其形态和增殖能力在传代过程中可以维持,流式细胞术证明了其与脂肪间充质干细胞的免疫表型相符,对其进行的成骨、成脂诱导分化均成功。合成多肽并溶解混合后,行原子力显微镜检测显示了多肽的纳米纤维样结构,其纳米纤维直径、长度均一,PBS成功诱发多肽溶液自组装成水凝胶,水凝胶固态透明、无色、质脆,且含水量极其丰富。扫描电镜检测水凝胶可见其内部为孔隙样结构,孔径大小为10-50μm。对比脂肪间充质干细胞在不同培养条件的两种水凝胶中生长,可见含细胞因子培养基中和的功能性自组装多肽水凝胶RADA/KLT中,脂肪间充质干细胞生长最好,细胞伸展、迁移且互相连接,AO/EB染色可见细胞在水凝胶内存活率很高。成功制作家兔后肢缺血模型后,家兔术侧后肢迅速出现跛行、皮温低、血压测不出、无脉等,使用不同的细胞移植方法进行治疗30d后,通过一般情况评价、组织切片评分、血管内皮细胞计数等方法,证明了移植负载脂肪间充质干细胞的功能性自组装多肽水凝胶组较单纯移植脂肪间充质干细胞组对家兔后肢缺血有着更好的治疗效果。结论：使用功能性自组装多肽水凝胶负载脂肪间充质干细胞进行干细胞移植治疗家兔后肢缺血,达到了较传统的脂肪间充质干细胞悬液注射法更好的治疗效果。
【关键词】：脂肪间充质干细胞 自组装多肽 水凝胶 细胞移植 缺血性疾病
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R543
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符号说明11-12
• 前言12-17
• 第一部分 脂肪间充质干细胞的原代培养与鉴定17-28
• 材料与方法18-23
• 结果23-25
• 讨论25-28
• 第二部分 功能性自组装多肽水凝胶的构建及体外复合脂肪间充质干细胞实验28-41
• 材料与方法30-34
• 结果34-36
• 讨论36-41
• 第三部分 功能性自组装多肽水凝胶负载脂肪间充质干细胞治疗家兔后肢缺血模型及效果评价41-53
• 材料与方法43-47
• 结果47-49
• 讨论49-53
• 结论53-54
• 附图54-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间发表的学术论文目录71-72
• 学位论文评阅及答辩情况表72

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本文编号：695699